Hohe genetische Barriere gegen SARS - Guangzhou CMM Co., Ltd

Nature Band 600, Seiten 512–516 (2021)Diesen Artikel zitieren

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Die Anzahl und Variabilität der neutralisierenden Epitope, auf die polyklonale Antikörper bei rekonvaleszenten und geimpften Personen mit SARS-CoV-2 abzielen, sind entscheidende Faktoren für die Neutralisierungsbreite und die genetische Barriere gegen die Virusflucht1,2,3,4. Anhand von HIV-1-Pseudotypen und Plasmaselektionsexperimenten mit vesikulären Stomatitis-Virus/SARS-CoV-2-Chimären5 zeigen wir hier, dass mehrere neutralisierende Epitope innerhalb und außerhalb der Rezeptorbindungsdomäne unterschiedlich von menschlichen polyklonalen Antikörpern angegriffen werden. Antikörperziele fallen mit Spike-Sequenzen zusammen, die für die Diversität in natürlichen SARS-CoV-2-Populationen angereichert sind. Durch die Kombination plasmaselektierter Spike-Substitutionen erzeugten wir synthetische „polymutierte“ Spike-Protein-Pseudotypen, die der Neutralisierung polyklonaler Antikörper in ähnlichem Maße widerstanden wie zirkulierende besorgniserregende Varianten. Indem wir Varianten besorgniserregender und antikörperselektierter Spike-Substitutionen in einem einzigen polymutierten Spike-Protein aggregieren, zeigen wir, dass 20 natürlich vorkommende Mutationen im SARS-CoV-2-Spike-Protein ausreichen, um Pseudotypen mit nahezu vollständiger Resistenz gegen die polyklonale Neutralisierung zu erzeugen Antikörper, die von rekonvaleszenten Personen oder Empfängern eines mRNA-Impfstoffs erzeugt werden. Allerdings neutralisierte das Plasma von Personen, die infiziert waren und anschließend eine mRNA-Impfung erhielten, Pseudotypen, die diesen hochresistenten SARS-CoV-2-Polymutanten-Spike oder verschiedene Sarbecovirus-Spike-Proteine tragen. Daher sollten optimal hervorgerufene humane polyklonale Antikörper gegen SARS-CoV-2 gegenüber erheblichen zukünftigen SARS-CoV-2-Variationen resistent sein und möglicherweise Schutz vor möglichen zukünftigen Sarbecovirus-Pandemien bieten.

Neutralisierende Antikörper, die durch eine frühere Infektion oder eine Impfung hervorgerufen wurden, stellen wahrscheinlich einen Schlüsselbestandteil der schützenden Immunität gegen SARS-CoV-2 dar. Es wird angenommen, dass Antikörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des Spike-Proteins abzielen, die neutralisierende Aktivität des Plasmas von Rekonvaleszenten oder Impfempfängern dominieren6 und dazu gehören die wirksamsten neutralisierenden Antikörper, die von rekonvaleszenten Personen geklont wurden7,8,9,10,11. Zu den weiteren neutralisierenden Antikörperzielen von SARS-CoV-2 gehören jedoch die N-terminale Domäne (NTD) und die Fusionsmaschinerie4,8,10,12,13 sowie das gesamte Spektrum an Epitopen, auf die neutralisierende Antikörper im Plasma von Rekonvaleszenten oder Impfempfängern abzielen nicht definiert. SARS-CoV-2-Varianten von Interesse (VOCs) oder Varianten von Interesse (VOIs) kodieren Spike-Aminosäuresubstitutionen14,15,16,17, von denen einige Resistenz gegen einzelne menschliche monoklonale Antikörper verleihen, aber unterschiedliche, typischerweise mäßige Auswirkungen auf die Neutralisierung haben durch polyklonale Plasmaantikörper1,6,9,17,18,19,20. Zu den mutierten Stellen in VOCs gehören solche im RBD, NTD und anderswo, aber die Anzahl und Orte der Spike-Substitutionen, die erforderlich sind, damit SARS-CoV-2 den polyklonalen neutralisierenden Antikörpern entgehen kann, die bei Empfängern eines Impfstoffs oder bei Rekonvaleszenten auftreten, sind unbekannt und von entscheidender Bedeutung Determinanten der Bevölkerungsimmunität.

Unter Ausnutzung der Tatsache, dass SARS-CoV durch SARS-CoV-2-Rekonvaleszenzplasma schlecht neutralisiert wird, verglichen wir die Empfindlichkeit von HIV-1-Pseudotypen, die parentale und chimäre Spike-Proteine tragen, in denen RBD-Sequenzen ausgetauscht wurden (SARS-CoV-2(1-RBD). ) und SARS-CoV(2-RBD); Abb. 1a, Erweiterte Daten Abb. 1) zur Neutralisierung durch Plasma von 26 Personen aus einer zuvor beschriebenen COVID-19-Rekonvaleszenzkohorte der Rockefeller University21. Die Plasmaproben wurden durchschnittlich 1,3 Monate nach der Infektion entnommen und hinsichtlich hoher SARS-CoV-2-Neutralisationstiter ausgewählt (RU27-Plasmapanel). Im Vergleich zum SARS-CoV-2-Pseudotyp reagierte der SARS-CoV-2(1-RBD)-Pseudotyp weniger empfindlich auf die Neutralisierung durch 21 der 26 Plasmen (mediane Differenz = 1,8-fach, Bereich 0,5–9,8-fach, P = 0,0005 (Wilcoxon-Zweiseitentest); Abb. 1b). Umgekehrt war der SARS-CoV(2-RBD)-Pseudotyp gegenüber allen Plasmen empfindlicher als der SARS-CoV-Pseudotyp (mediane Differenz = 8-fach, Bereich 1,2–75,5-fach, P < 0,0001 (zweiseitiger Wilcoxon-Test); Abb. 1c). Dennoch wurde die neutralisierende Wirksamkeit einiger Plasmen kaum beeinträchtigt, als das SARS-CoV-2-RBD durch das SARS-CoV-RBD ersetzt wurde, obwohl einige dieser Plasmen nur minimal aktiv gegen SARS-CoV waren (z. B. RU9, RU10, RU11). und RU15; Abb. 1b, c). Tatsächlich neutralisierten Plasmen, die SARS-CoV schlecht neutralisierten, chimäre Spike-Pseudotypen entweder mit RBD oder den anderen Spike-Domänen von SARS-CoV-2 wirksam (Abb. 1b, c). Für das Plasma-Panel als Ganzes korrelierte die pseudotypneutralisierende Wirksamkeit gegen SARS-CoV-2 nicht mit der Wirksamkeit gegen SARS-CoV oder SARS-CoV-2(1-RBD), wohl aber mit der Wirksamkeit gegen SARS-CoV(2-RBD). RBD) (Erweiterte Daten Abb. 2a–c). Obwohl eine veränderte Konformation des RBD in chimären Spike-Proteinen die Neutralisierung beeinflussen könnte, deuten diese Daten darauf hin, dass das RBD zwar ein wichtiges neutralisierendes Ziel darstellt, eine erhebliche neutralisierende Aktivität im Plasma jedoch auch gegen Nicht-RBD-Epitope gerichtet ist.

a, Design von RBD-ausgetauschten chimären Spike-Proteinen. b, c, NT50 für 26 Rekonvaleszenzplasmen mit hohem Titer (aus dem RU1–27-Panel) gegen pseudotypisierte HIV-1-Virionen, die die angegebenen Spike-Proteine tragen. Dargestellt ist der Median zweier unabhängiger Experimente. FP, Fusionspeptid; HR, Heptad-Wiederholung; TM, Transmembran.

Quelldaten

Um die Ziele polyklonaler neutralisierender Antikörper bei rekonvaleszenten Personen genauer abzubilden, haben wir ein rekombinantes vesikuläres Stomatitis-Virus (rVSV)/chimäres SARS-CoV-2-Virus1,5 in Gegenwart jedes der RU27-Plasmen für bis zu sechs Passagen passagiert . rVSV/SARS-CoV-2 ahmt die Neutralisierungseigenschaften von SARS-CoV-2 nach (Ref. 1,5), vermeidet jedoch die Sicherheitsbedenken, die solche Studien mit authentischem SARS-CoV-2 begleiten würden. Die Sequenzierung der nächsten Generation zeigte, dass die Passage von rVSV/SARS-CoV-2 in 22 der 27 Plasmen zur Selektion von Spike-Mutanten führte (Abb. 2a, Erweiterte Daten Abb. 3, Ergänzungstabelle 1). Bei einigen Plasmen wurden mehrere Substitutionen an unterschiedlichen, aber proximalen Stellen in viralen Subpopulationen ausgewählt, was auf eine dominante neutralisierende Aktivität hinweist, die auf ein bestimmtes Epitop abzielt. Bei anderen Plasmen waren die Substitutionen in mehreren Regionen der Spike-kodierenden Sequenz angereichert, was auf co-dominante neutralisierende Aktivitäten schließen lässt. Sechs Passagen von rVSV/SARS-CoV-2 ohne Plasma reichern eine kleine Anzahl von Substitutionen an, von denen angenommen wird, dass sie Zellkultur- oder Fitness-steigernde Anpassungen darstellen (z. B. T604I), die sich jedoch von der Mehrzahl der Substitutionen unterscheiden, die nach rVSV/ SARS-CoV-2-Passage im Plasma (Extended Data Abb. 3, Ergänzungstabelle 1). Kumulativ wurden die plasmaselektierten Mutationen an spezifischen Elementen innerhalb der NTD-, RBD- und anderen Spike-Domänen angereichert (Abb. 2a, Ergänzungstabelle 1). Aus den 27 plasmapassierten Viruspopulationen wurden 38 einzelne mutierte Viren durch Plaquereinigung isoliert; Jeder kodierte eine, zwei oder drei Spike-Substitutionen (Abb. 2b), die in den passagierten Viruspopulationen im Allgemeinen mit hoher Häufigkeit auftraten (Ergänzungstabelle 1).

a, Häufigkeit von Aminosäuresubstitutionen an jedem Codon des SARS-CoV-2-Spike-Proteins in zwei unabhängigen rVSV/SARS-CoV-2-Populationen (1D7 und 2E1), bestimmt durch Illumina-Sequenzierung. Es werden gepoolte Ergebnisse nach Auswahl mit dem RU27-Plasmapanel angezeigt. b, Orte der Aminosäuresubstitutionen in 38 Plaque-gereinigten rVSV/SARS-CoV-2-Isolaten, die aus rVSV/SARS-CoV-2-Populationen nach Passage in den RU27-Plasmen gewonnen wurden. c, Häufigkeit natürlich vorkommender Aminosäuresubstitutionen (rote Kreise) an jedem Codon des SARS-CoV-2-Spike-Proteins. Die schattierten grauen Balken in a–c zeigen gemeinsame Bereiche an, in denen die Variation bereichert ist. d, Vergleich der durchschnittlichen Häufigkeit von Substitutionen, die nach der Passage von rVSV/SARS-CoV-2 mit RU27-Plasmen beobachtet wurden (Mitte) und der Häufigkeit von Sequenzänderungen in natürlichen Populationen (rechts), projiziert auf die SARS-CoV-2-Spike-Struktur (PDB). 6VXX) mit den angegebenen Positionen von RBD und NTD (links). Die durchschnittliche Häufigkeit von Substitutionen in einem Radius von 15 Å wird anhand des Farbspektrums dargestellt (Skala = 0–20 (Mitte) und 0–9 (rechts)). e, Neutralisierungsstärke von RU27-Plasmen gegen rVSV/SARS-CoV-2, das Wildtyp (WT), individuell ausgewählte Mutanten oder PMS1-1-Spike-Proteine kodiert. Es wird ein Median zweier unabhängiger Bestimmungen aufgetragen.

Quelldaten

Wir verglichen die Verteilung der durch rVSV/SARS-CoV-2-Passage ausgewählten Mutationen mit dem RU27-Plasmapanel mit denen, die in zirkulierenden SARS-CoV-2-Populationen auftreten (Abb. 2a–d). Sowohl in plasmaselektierten als auch in natürlich vorkommenden Sequenzen wurden Substitutionen in mehreren Elementen angereichert, die zur „Supersite“ beitragen, auf die NTD-bindende neutralisierende Antikörper abzielen (Abb. 2a – d). Ähnliche plasmaselektierte und natürliche Sequenzvariationen waren auch bei Elementen erkennbar, auf die RBD-bindende neutralisierende Antikörper der Klassen 2 und 3 abzielen22. Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie Resistenzen gegen RBD-Antikörper der Klasse I verleihen, wurden nicht durch Plasmapassage ausgewählt, was möglicherweise auf eine geringere als erwartete Häufigkeit von Klasse-I-Antikörpern in diesem Plasmapanel zurückzuführen ist (Abb. 2a–d). Andere Stellen, darunter Spike-Aminosäuren etwa 680–700 und etwa 930, zeigten Variationen sowohl in den Datensätzen mit Plasma-Passagierung als auch in natürlichen Varianten, es konnte jedoch noch nicht nachgewiesen werden, dass sie von neutralisierenden Antikörpern angegriffen werden. Dennoch legt die Ähnlichkeit in der Verteilung natürlicher und plasmaselektierter Sequenzvariationen innerhalb des Spike-Proteins nahe, dass die Selektion durch neutralisierende Antikörper ein Treiber für die Divergenz in zirkulierenden SARS-CoV-2-Populationen ist.

Von den 38 Plaque-gereinigten rVSV/SARS-CoV-2-Mutanten, die nach der Passage in RU27-Plasmen gewonnen wurden, zeigten 34 unterschiedlich stark verringerte Empfindlichkeit gegenüber der Neutralisierung durch das Plasma, das für ihre Selektion verwendet wurde (durchschnittlich 3,1-fach verringerter halbmaximaler Neutralisierungstiter). (NT50), Bereich 0,8–39,3-fach; Erweiterte Daten Abb. 4, 5). Dennoch zeigte das Selektionsplasma bei 37 der 38 ausgewählten rVSV/SARS-CoV-2-Mutanten eine restliche neutralisierende Aktivität. Wir haben 13 Mutationen der plasmaselektierten Viren basierend auf ihren Auswirkungen auf die Plasmaneutralisationsempfindlichkeit (Extended Data Abb. 4, 5) und die Verteilung im gesamten Spike-Protein aggregiert und so eine einzige synthetische „polymutierte“ Spike-Proteinsequenz (PMS) mit der Bezeichnung PMS1 erzeugt -1 (Erweiterte Daten Abb. 6a). Ein rVSV/SARS-CoV-2-Derivat, das diese Spike-Mutationen kodiert (rVSV/SARS-CoV-2PMS1-1), zeigte eine Resistenz gegen Neutralisierung durch das RU27-Plasmapanel, die in Ausmaß und Konsistenz größer war als die einzelnen plasmaselektierten Mutanten (Median 8,0). -fach, Bereich 2,7–52,9-fach; Abb. 2e). Dennoch behielten 26 der 27 RU27-Plasmen eine restliche neutralisierende Aktivität gegen rVSV/SARS-CoV-2PMS1-1 (Abb. 2e, Erweiterte Daten Abb. 6b). Wir kommen zu dem Schluss, dass einige neutralisierende Epitope unter den Rekonvaleszenzantikörpern in Plasmen mit hohem Titer geteilt werden, die neutralisierende Aktivität gegen SARS-CoV-2 jedoch eindeutig polyklonal und bei Individuen in Bezug auf Epitopziele heterogen ist.

Wir haben eine Reihe von HIV-1-Pseudotypen erstellt, die das PMS1-1-Spike-Protein, ein zweites PMS-Protein mit einem anderen Satz von 13 Mutationen (ausgewählt nach ähnlichen Kriterien; bekannt als PMSD4) oder natürlich vorkommende Varianten oder Verwandte des SARS-1 tragen. CoV-2-Spike-Protein (Extended Data Abb. 7a, b). Das Gremium umfasste mehrere VOC- oder VOI-Spike-Proteine von SARS-CoV-2 sowie Spike-Proteine von Sarbecoviren, die in Fledermäusen (bCoV-RaTG13), Schuppentieren (pCoV-GD und pCoV-GX) und früher auch im Menschen (SARS-CoV) vorkommen weisen unterschiedliche Grade an Sequenzdivergenz von SARS-CoV-2 auf (Ref. 23,24,25) (siehe Extended Data Abb. 1 zur Pseudotypcharakterisierung). Um die Empfindlichkeit und Resistenz gegenüber polyklonalen SARS-CoV-2-Antikörpern zu bestimmen, verwendeten wir einen unabhängigen Satz von 21 zufällig ausgewählten (Ran1–21) Rekonvaleszenzplasmen und einen Satz von 14 Plasmen von Empfängern, die einen mRNA-Impfstoff erhalten hatten (Vac1–14). zusätzlich zum Hochtiter-Plasmapanel RU27. Die PMS-Spike-Proteine wiesen einen Grad an Neutralisationsresistenz auf, der mit der Reichweite der vier SARS-CoV-2-VOCs/VOIs und der vier anderen Sarbecoviren abnahm (Extended Data Abb. 8a–c, 9a–c). Insbesondere zeigten PMS1-1 und PMSD4 eine Neutralisationsbeständigkeit, die größer als B.1.1.7 VOC und B.1.526 VOI war, ähnlich wie P.1 VOC und kleiner als B.1.351.3 VOC. PMS1-1 und PMSD4 waren resistenter gegen Neutralisierung als pCoV-GD und bCoV-RaTG13, die beide eine größere Anzahl an Veränderungen im Vergleich zu SARS-CoV-2 aufweisen als die PMS-Spike-Proteine. Umgekehrt waren die Pseudotypen pCoV-GX und SARS-CoV resistenter gegen Plasma von SARS-CoV-2-Rekonvaleszenten oder Impfempfängern als PMS1-1 und PMSD4 (Extended Data Abb. 8a–c, 9a–c). Bemerkenswert ist, dass B.1.351.3 VOC, das im Vergleich zu SARS-CoV-2 Wuhan-hu-1 nur neun Spike-Mutationen kodiert, wie PMS1-1 und PMSD4 resistenter gegen Neutralisierung war als Sarbecoviren (pCoV-GD und bCoV-RaTG13). die eine größere Anzahl an Substitutionen enthalten, was darauf hindeutet, dass die B.1.351.3-Mutationen durch Antikörperdruck selektiert wurden.

Auf der Grundlage der oben genannten Erkenntnisse haben wir versucht, ein mutiertes SARS-CoV-2-Spike-Protein zu erzeugen, das minimal von SARS-CoV-2 Wuhan-hu-1 abweicht, aber dennoch resistent gegen Neutralisierung durch polyklonales Rekonvaleszenz- und Impfstoffempfängerplasma ist. Die erfolgreiche Ableitung eines solchen Spike-Proteins würde eine vollständige Liste der Neutralisationsepitope identifizieren, die von polyklonalen Antikörpern erkannt werden. Wir haben 20 natürlich vorkommende Mutationen ausgewählt, darunter 8 NTD- und 8 RBD-Änderungen (Abb. 3a), die entweder (1) in unseren Plasmaselektionsexperimenten entstanden sind (Abb. 2b), (2) in VOCs mit verringerter Neutralisationsempfindlichkeit auftreten (Extended Data Abb . 7, 8) oder (3) traten in unseren früheren Studien auf, in denen die Resistenz gegen menschliche monoklonale Antikörper ausgewählt wurde1,2,9. Natürlich vorkommende Deletionsmutationen im NTD (Extended Data Abb. 7b) sowie mehrfache Substitutionen, die Resistenz gegen RBD-bindende Antikörper der Klassen 1, 2 und 3 verleihen1,2,9 wurden einbezogen. Ein rVSV/SARS-CoV-2-Derivat, das die resultierende Spike-Sequenz kodiert und als PMS20 bezeichnet wird (Abb. 3a), war replikationskompetent, aber im Vergleich zu rVSV/SARS-CoV-22E1 abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass die 20 Mutationen einen Fitnessaufwand verursachen (Abb. 3b). Dennoch waren HIV-1-Pseudotypen, die PMS20 trugen, ähnlich infektiös wie diejenigen, die das elterliche Spike-Protein trugen (Extended Data, Abb. 1) und äußerst resistent gegen Neutralisierung. Tatsächlich führten 17 der 21 zufälligen Rekonvaleszenten und 8 der 14 mRNA-Impfstoffempfängerplasmen zu einer nicht nachweisbaren Neutralisierung von PMS20-Pseudotypen (weniger als 1:50; Abb. 3c). Unter den rekonvaleszenten RU27-Plasmen mit hohem Titer hatten 23 von 27 eine restliche neutralisierende Aktivität gegen PMS20, die im Vergleich zum Elternpseudotyp im Median um das 32-fache reduziert war (Bereich 2,8–114-fach; erweiterte Daten, Abb. 9a). Wir kommen zu dem Schluss, dass die 20 Mutationen im PMS20-Spike-Protein ausreichen, um den Großteil der Antikörper im Plasma von Personen zu umgehen, die mit SARS-CoV-2 infiziert oder gegen SARS-CoV-2 geimpft wurden.

a, Design des PMS20-Spike-Proteins mit 20 Antikörper-selektierten und VOC-assoziierten Mutationen. b, Replikation von rVSV/SARS-CoV-2-Chimären, die für 2E1- (Eltern) oder PMS20-Spike-Proteine kodieren, in 293T/ACE2cl.22-Zellen, die mit einer Multiplizität von 0,001 bzw. 0,008 infiziert wurden. c, Vergleichende Neutralisationsstärke von zufällig ausgewählten Rekonvaleszenten- (Ran1–21; links) und Impfplasmen (Vac1–14; rechts) gegen die Pseudotypen Wuhan-hu-1 und PMS20 (b) SARS-CoV-2 HIV-1. Für b und c ist der Median ± Bereich zweier unabhängiger Bestimmungen aufgetragen.

Quelldaten

Im Gegensatz zu Plasmen von Personen, die infiziert oder geimpft waren, wurde eine Gruppe von Plasmen von 14 Personen, die als „infiziert-dann-geimpft“ (ITV) bezeichnet werden und sowohl mit SARS-CoV-2 infiziert waren als auch anschließend mRNA-Impfstoffe3 erhalten hatten, beibehalten neutralisierende Aktivität gegen HIV-1-Pseudotypen, die den PMS20-Spike tragen (Abb. 4a, b). Tatsächlich verursachten die PMS20-Mutationen, die die NT50-Werte im Ran21- und Vac14-Plasma im Median um das 50-fache (Bereich 5,9–225-fach) bzw. 81-fach (Bereich 8,4–229-fach) reduzierten, nur eine mittlere NT50-Reduktion von 18,6-fach (Bereich 3,9–100-fach) für das ITV-Plasmapanel (Abb. 4a, b). Die Analyse chimärer SARS-CoV-2/PMS20-Spike-Proteine, bei denen die jeweiligen RBDs ausgetauscht wurden (PMS20(2-RBD) und SARS-CoV-2(PMS-RBD)), zeigte, dass die relative Resistenz des PMS20-Spike-Proteins gegen beide Ran- und ITV-Plasmen wurden durch mehrere Spike-Determinanten vermittelt und die Neutralisationsbreite in den ITV-Plasmen war auf Antikörper zurückzuführen, die sowohl gegen RBD- als auch gegen Nicht-RBD-Determinanten gerichtet waren (Abb. 4a). Zusätzlich zu der zuvor berichteten starken neutralisierenden Aktivität von ITV-Plasmen gegen die VOCs B.1.1.7, B.1.525, P.1 und B.1.351.33 neutralisierten die ITV-Plasmen auch B.1.617.2 (Delta) wirksam. sowie eine kürzlich beschriebene Variante (A.VOI.V2)26, die 11 Substitutionen und 3 Deletionen im Spike-Protein aufweist, einschließlich einer stark mutierten NTD, und voraussichtlich sowohl gegen RBD-Bindungsneutralisierung der Klasse 2 als auch der Klasse 3 resistent ist Antikörper (Extended Data Abb. 10a).

a, Vergleichende Neutralisationsstärke (NT50-Werte) von zufälligen Rekonvaleszenzplasmen (Ran1–21; links) und ITV-Plasmen (ITV1–14; rechts) gegen HIV-1-Pseudotypen, die SARS-CoV-2, PMS20 und RBD-ausgetauschte chimäre Spike-Proteine tragen. b, Faltungsunterschied in NT50, Vergleich der Neutralisierung von HIV-1-Pseudotypen, die SARS-CoV-2- und PMS20-Spike-Proteine tragen, durch Ran1–21-, Vac1–15- und ITV1–14-Plasmen (die P-Werte wurden mithilfe eines zweiseitigen Mann– berechnet Whitney-Test; horizontale Linien zeigen Medianwerte an). c, Neutralisationskurven für ITV-Plasmen und die angegebenen Sarbecovirus-HIV-1-Pseudotypen. Für a und c ist der Median ± Bereich zweier unabhängiger Bestimmungen aufgetragen.

Quelldaten

Plasma von ITV-Individuen hatte auch eine erhebliche neutralisierende Aktivität gegen heterologe Sarbecovirus-HIV-1-Pseudotypen, einschließlich solcher, die durch Ran21-, Vac14- und RU27-Plasmapanels schlecht neutralisiert wurden und deren RBD- und/oder NTD-Sequenzen stark von SARS-CoV-Sequenzen abweichen. 2 (Abb. 4c, Erweiterte Daten Abb. 10a, b). Die mittleren NT50-Werte für die ITV-Plasmen gegen Sarbecovirus-Pseudotypen betrugen 5.330 (Bereich 2.369–7.222) für bCoV-RaTG13, 3.617 (Bereich 1.780–6.968) für pCoV-GX, 2.605 (Bereich 1.386–3.181) für bCoV-WIV16 und 1.208 ( Bereich 621–2.705) für SARS-CoV (Abb. 4c, Erweiterte Daten Abb. 10a). Bemerkenswerterweise war die neutralisierende Aktivität der ITV-Plasmen gegen die divergenten Sarbecoviren bCoV-WIV16 und SARS-CoV ähnlich der, die in den zufälligen Rekonvaleszenzplasmen gegen SARS-CoV-2 Wuhan-hu-1 gefunden wurde. Daher scheinen die Neutralisierungsstärke und -breite des polyklonalen Plasmas nach der mRNA-Impfung von Personen, die zuvor mit SARS-CoV-2 infiziert waren, größer zu sein als bisher angenommen.

Diese Ergebnisse weisen auf das Vorhandensein zahlreicher neutralisierender Antikörperziele auf dem SARS-CoV-2-Spike-Protein hin. Unsere jüngsten Analysen deuten darüber hinaus darauf hin, dass die Affinitätsreifung über Monate der Rekonvaleszenz den Antikörpern Flexibilität und Affinität verleiht2,3,27 und die Notwendigkeit mehrerer viraler Substitutionen für die Flucht vor einzelnen neutralisierenden Antikörpern mit sich bringen kann. Einige menschliche monoklonale Antikörper weisen daher eine erhebliche Aktivität gegen SARS-CoV-2-Varianten und divergente Sarbecoviren2,28 auf. Insgesamt erklärt die Vielfalt, Reife und hohe Konzentration neutralisierender Antikörper wahrscheinlich, warum polyklonales Plasma von Personen, die sowohl infiziert als auch anschließend geimpft wurden, die ansonsten stark neutralisierungsresistente PMS20-Polymutante sowie Sarbecoviren, die von SARS-CoV abweichen, wirksam neutralisieren könnte -2. Während Standard-mRNA-Impfschemata möglicherweise weniger wirksam sind als eine Infektion, wenn es darum geht, die Breite individueller Antikörper hervorzurufen29, bleibt abzuwarten, ob die Stärke und Breite der polyklonalen Neutralisierung durch eine zeitlich angemessen abgestimmte Auffrischimpfung mit bestehenden SARS-CoV-2-Impfstoffen erreicht werden kann. Wenn ja, könnten vorhandene Immunogene einen robusten Schutz gegen zukünftige SARS-CoV-2-Varianten und einen gewissen Schutz gegen verschiedene potenzielle zukünftige Sarbecovirus-Bedrohungen bieten. Umgekehrt können PMS-Proteine, die zahlreiche Neutralisations-Escape-Mutationen kodieren, nützliche Immunogene darstellen, um die polyklonale Antikörperantwort zu erweitern, die durch SARS-CoV-2-Impfstoffe der ersten Generation hervorgerufen wird.

293T-Zellen (American Type Culture Collection (ATCC) CRL-11268), 293T/ACE2cl.22- und HT1080/ACE2.cl.14-Zellen5 stammten aus Originalbeständen, die von der ATCC erworben wurden, und es wurde angenommen, dass sie von der ATCC authentifiziert wurden. Die Zellen wurden regelmäßig durch DAPI-Färbung bzw. Reverse-Transkriptase-Assays auf Mykoplasmen- und Retrovirus-Kontamination überprüft.

Die Plasmide pSARS-CoV-2-SΔ19 und pSARS-CoV-SΔ19, die C-terminal verkürzte SARS-CoV-2- (NC_045512) und SARS-CoV-Spike-Proteine exprimieren, wurden bereits beschrieben5 und wurden zur Konstruktion des SARS-CoV-2(1) verwendet -RBD) und SARS-CoV(2-RBD)-Expressionsplasmide, in denen RBD-kodierende Sequenzen gegenseitig ausgetauscht wurden. Im Kontext von pSARS-CoV-2-SΔ19 (R683G)5 wurde eine Reihe von Plasmiden konstruiert, die Spike-Proteine aus SARS-CoV-2 VOC und VOI exprimieren. Substitutionen wurden mithilfe synthetischer Genfragmente (IDT) oder mittels Overlap-Extension-PCR-vermittelter Mutagenese und Gibson-Assemblierung eingeführt. Alle VOCs/VOIs und polymutierten Spike-Proteine enthielten auch die R683G-Substitution, die die Furin-Spaltungsstelle stört und höhere Titer-Virusbestände erzeugt, ohne signifikante Auswirkungen auf die Neutralisierungsempfindlichkeit pseudotypisierter Viren (Erweiterte Daten, Abb. 1c, d). Die Potenzen, mit denen das Plasma Mitglieder des mutierten Pseudotyp-Panels neutralisierte, wurden mit Potenzen gegen eine „Wildtyp“-SARS-CoV-2-Spike-Sequenz verglichen, die gegebenenfalls R683G trug. Plasmide, die die Spike-Proteine exprimieren, die im Hufeisennase (Rinolophus affinis)-Coronavirus bCoV-RaTG13 (Ref. 23) sowie in den Pangolin-Coronaviren (Manis javanica) aus Guangdong, China (pCoV-GD) und Guanxi, China (pCoV-GX) gefunden werden )24,25 wurden ähnlich konstruiert. Spike-Sequenzen wurden codonmodifiziert, um die Homologie mit der menschlichen Codonnutzung zu maximieren, die für das pSARS-CoV-2-exprimierende Plasmid VG40589-UT (Sinobiological) optimiert wurde. Die 19 Aminosäuren verkürzte kodierende Sequenz (CDS) von bCoV-RaTG13 (QHR63300), pCoV-GD (CoV_EPI_ISL_410721) und pCoV-GX (CoV_EPI_ISL_410542) wurden von GeneART synthetisiert und unter Verwendung von NheI und XbaI und Gibson-Assemblierung in pCR3.1 subkloniert. und als pCR3.1-bCoV-RaTG13-SΔ19, pCR3.1pCoV-GD-SΔ19 bzw. pCR3.1-pCoV-GX-SΔ19 bezeichnet. Pseudotypisierte HIV-1-Partikel wurden wie zuvor beschrieben erzeugt5. Konkret wurden Virusbestände 48 Stunden nach der Transfektion von 293T-Zellen mit pHIV-1 GagPol und pCCNano/LucGFP (Abb. 1) oder pNL4-3ΔEnv-nanoluc (alle anderen Abbildungen) zusammen mit einem Spike-Expressionsplasmid geerntet, gefiltert und bei – gelagert 80 °C.

Die Plasmen wurden fünffach seriell verdünnt und dann mit pseudotypisiertem HIV-1-Reportervirus 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Das Antikörper-Pseudotyp-Virus-Gemisch wurde dann zu HT1080/ACE2.cl14-Zellen gegeben. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit Luciferase Cell Culture Lysis Reagenz (Promega) lysiert und die Nanoluc-Luciferase-Aktivität in Lysaten wurde mit dem Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega) und einem Glomax Navigator Luminometer (Promega) gemessen. Die relativen Lumineszenzeinheiten wurden auf diejenigen normalisiert, die von Zellen stammen, die in Abwesenheit von Plasma mit dem pseudotypisierten Virus infiziert waren. Der NT50 wurde mithilfe einer nichtlinearen Regression mit vier Parametern (Regressionsmethode der kleinsten Quadrate ohne Gewichtung) (GraphPad Prism) ermittelt.

Die Plasmaproben stammten von Personen, die vor der Plasmaspende durchschnittlich 1,3 Monate lang mit SARS-CoV-2 infiziert waren7, oder von Personen, die vor der Plasmaspende zu verschiedenen Zeitpunkten mRNA-Impfstoffe erhalten hatten9. Ein Satz von 27 Plasmaproben von Personen, die mit SARS-CoV-2 mit hoher neutralisierender Aktivität infiziert und nicht geimpft waren7, das so genannte „RU27“-Plasmapanel, wurde in VSV-SARS-CoV-2-Auswahlverfahren verwendet, während dieses Panel plus Ein zweiter Satz von 21 zufällig ausgewählten Plasmen (zufällig ausgewählt mit Verblindung des Neutralisationstiters oder eines anderen demografischen Merkmals) aus derselben Rekonvaleszenzkohorte bildete das „Ran21“-Plasmapanel7. Ein Satz von 14 Plasmen, die von Personen gespendet wurden, die einen mRNA-Impfstoff von Pfizer/BioNTech erhalten hatten, bildete das „Vac14“-Plasmapanel9. Schließlich bildete ein Satz von 15 Plasmen von rekonvaleszenten Personen, die zwischen 6 und 12 Monaten nach der Infektion einen mRNA-Impfstoff von Pfizer/BioNTech erhalten hatten3, das „ITV15“-Plasmapanel der infizierten und dann geimpften Personen. Die Studienbesuche und Blutabnahmen erfolgten mit Einverständniserklärung aller Teilnehmer gemäß einem Protokoll, das vom Institutional Review Board der Rockefeller University überprüft und genehmigt wurde (IRB-Nr. DRO-1006, „Peripheres Blut von Coronavirus-Überlebenden zur Identifizierung von Virusneutralisierern“) Antikörper‘).

Um plasmaresistente Spike-Varianten auszuwählen, wurden rVSV/SARS-CoV-2/GFP1D7 und rVSV/SARS-CoV-2/GFP2E1 passagiert, um Diversität zu erzeugen, und Populationen mit 106 Plaque-bildenden Einheiten wurden mit Plasma (verdünnt 1:50) inkubiert –1:400) für 1 Stunde bei 37 °C vor der Inokulation von 2 × 105 293T/ACE2cl.22-Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen. Am folgenden Tag wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt, das die gleichen Plasmakonzentrationen enthielt. Der Überstand aus den Vertiefungen mit den höchsten Konzentrationen an Plasmaantikörpern, die Anzeichen einer rVSV/SARS-CoV-2/GFP-Replikation zeigten (große Anzahl GFP-positiver Zellen oder GFP-positiver Herde), wurde 24 Stunden später geerntet. Danach wurden Aliquots (100 µl) des geklärten Überstands aus der ersten Passage (p1) mit der gleichen oder einer erhöhten Plasmakonzentration inkubiert und dann wie zuvor zur Infektion von 2 × 105 293T/ACE2cl.22-Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen verwendet (S. 2). In Situationen, in denen kleine, aber expandierende GFP-positive Herde beobachtet wurden, wurde das Medium nach 48 Stunden mit frischem Medium ohne Plasma aufgefrischt und das Virus 24 Stunden später geerntet. Wir wiederholten diesen Vorgang für bis zu sechs Passagen oder bis eine verringerte Neutralisierungswirkung für das Plasma offensichtlich wurde, was durch den visuellen Nachweis einer zunehmenden Anzahl GFP-positiver Zellen während der Passage angezeigt wurde.

Um einzelne mutierte Viren durch Grenzverdünnung zu isolieren, wurden die ausgewählten rVSV/SARS-CoV-2/GFP1D7- und rVSV/SARS-CoV-2/GFP2E1-Populationen in Abwesenheit von Plasma seriell verdünnt und Aliquots jeder Verdünnung in einzelne Vertiefungen von 96 gegeben -Well-Platten mit 1 × 104 293T/ACE2cl.22-Zellen. Einzelne Virusvarianten wurden durch Beobachtung einzelner GFP-positiver Plaques in einzelnen Vertiefungen bei Grenzverdünnungen identifiziert. Die Plaque-gereinigten Viren wurden vermehrt, RNA extrahiert und Spike-Sequenzen bestimmt.

Plasmaproben wurden fünffach seriell verdünnt und dann mit rVSV/SARS-CoV-2/GFP1D7 und rVSV/SARS-CoV-2/GFP2E1 oder Plaque-gereinigten ausgewählten Varianten davon 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Das Antikörper-rekombinante Virus-Gemisch wurde dann zu 293T/ACE2.cl22-Zellen gegeben. Nach 16 Stunden wurden die Zellen geerntet und die infizierten Zellen mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Der Prozentsatz der infizierten Zellen wurde auf den Prozentsatz normalisiert, der aus mit rVSV/SARS-CoV-2 infizierten Zellen in Abwesenheit von Plasma stammte. Der NT50-Wert für jedes Plasma wurde mithilfe einer nichtlinearen Regression mit vier Parametern (Regressionsmethode der kleinsten Quadrate ohne Gewichtung) (GraphPad Prism) bestimmt.

Um mutmaßliche Antikörperresistenzmutationen zu identifizieren, wurde RNA aus Aliquots von Überständen isoliert, die ausgewählte Viruspopulationen oder einzelne Plaque-gereinigte Varianten enthielten, unter Verwendung des NucleoSpin 96 Virus Core Kit (Macherey-Nagel). Die gereinigte RNA wurde einer reversen Transkription unter Verwendung von Zufallshexamerprimern und dem SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) unterzogen. Die cDNA wurde mit KOD Xtreme Hot Start DNA Polymerase (Millipore Sigma) amplifiziert. Konkret wurde ein Fragment einschließlich der kodierenden Region der extrazellulären Domäne des Spike-Proteins unter Verwendung von Primern amplifiziert, die auf die intergene Region zwischen VSV-M und Spike sowie auf die intrazelluläre Spike-Domäne abzielen. Die PCR-Produkte wurden gereinigt und entweder mithilfe der Sanger-Sequenzierung oder der Illumina-Sequenzierung wie zuvor beschrieben30 sequenziert. Für die Illumina-Sequenzierung wurde 1 µl verdünnte DNA mit 0,25 µl Nextera TDE1 Tagment DNA-Enzym (15027865, Illumina) und 1,25 µl TD Tagment DNA-Puffer (15027866, Illumina) verwendet. Anschließend wurde die DNA mit dem Illumina Nextera XT Index Kit v2 und KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X; KAPA Biosystems) an i5/i7-Barcode-Primer ligiert. Als nächstes wurde die DNA mit AmPure Beads XP (Agencourt) gereinigt, gepoolt und mit Illumina MiSeq Nano 300 V2 Cycle Kits (Illumina) in einer Konzentration von 12 pM sequenziert (gepaartes Ende).

Zur Analyse der Illumina-Sequenzierungsdaten wurden Adaptersequenzen mithilfe von BBDuk aus den Roh-Reads und Reads mit geringer Qualität (Phred-Qualitätsfaktor unter 20) entfernt. Gefilterte Lesevorgänge wurden auf die Codon-optimierte SARS-CoV-2-S-Sequenz in rVSV/SARS-CoV-2/GFP abgebildet und Mutationen wurden mit Geneious Prime (Version 2020.1.2) unter Verwendung eines P-Wert-Grenzwerts von 10− annotiert 6. RBD-spezifische Variantenhäufigkeiten, P-Werte und Lesetiefe wurden mit Python unter Pandas (1.0.5), Numpy (1.18.5) und Matplotlib (3.2.2) kompiliert. Die parentalen rVSV/SARS-CoV-2/GFP 2E1- und 1D7-Sequenzen enthalten jeweils zwei adaptive Mutationen (F157S und R685M für 1D7; D215G und R683G für 2E1), wurden jedoch für die Zwecke der Plasmaselektionsexperimente jeweils als „Wildtyp“ betrachtet und wurden von den Analysen der Sequenzen abgezogen.

Die Häufigkeit von Aminosäuresubstitutionen während der rVSV/SARS-CoV-2-Passage in Plasmen wurde mit der Häufigkeit globaler Veränderungen an jedem Rest am 11. Mai 2021 verglichen (Los Alamos, COVID-19 Viral Genome Analysis Pipeline; https:// cov.lanl.gov/content/index)31. Zum Vergleich von SARS-CoV-2 mit Sarbecoviren wurden die Aminosäuresequenzen mit Clustal Omega abgeglichen. Unter Verwendung eines Python-Skriptklons von Simplot (https://jonathanrd.com/20-05-02-writing-a-simplot-clone-in-python/) wurde die prozentuale Identität relativ zu SARS-CoV-2 innerhalb von a berechnet rollierendes Fenster von 100 Aminosäuren, wobei jeweils ein einzelner Rest schrittweise durchlaufen wird.

Für die dreidimensionale Schiebefensteranalyse von Veränderungen in der Spike-Aminosäuresequenz, die global und in vitro beobachtet wurden, wurde die Häufigkeit des globalen Auftretens von Veränderungen an jedem Rest ermittelt (Los Alamos, COVID-19 Viral Genome Analysis Pipeline, https://cov.lanl .gov/content/index)31 wurde durch die durchschnittliche Änderungshäufigkeit an jedem Standort geteilt und in der SARS-CoV-2-Spike-Struktur PDB 6VXX32 als relative Änderungshäufigkeit unter Verwendung von BioStructMap33,34 projiziert. Alternativ wurde die durchschnittliche Häufigkeit von Substitutionen, die nach der Passage von rVSV/SARS-CoV-2 mit Plasma beobachtet wurde, durch die mittlere Substitutionshäufigkeit dividiert und als dreidimensionales Schiebefenster über der Spike-Struktur angewendet. Die durchschnittliche Häufigkeit von Substitutionen in einem Radius von 15 Å wird anhand eines Farbspektrums dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.

Daten zu plasmaselektierten Mutationen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Während der aktuellen Studie erstellte Neutralisationstest-Datensätze sind in den beigefügten ergänzenden Quelldatendateien verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Für die Analysen wurde kommerziell erhältliche Software verwendet. Es wurde kein neuer Code generiert

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Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse R37AI64003 und R01AI501111 der US National Institutes of Health (an PDB) unterstützt; R01AI78788 (bis TH); und P01-AI138398-S1 und 2U19AI111825 (an MCN). DP wurde durch ein Medical Scientist Training Program-Stipendium des NIGMS (T32GM007739) für das Weill Cornell/Rockefeller/Sloan Kettering Tri-Institutional MD-PhD Program und durch das NIAID (F30AI157898) unterstützt. CG wurde vom Robert S. Wennett Post-Doctoral Fellowship, teilweise vom National Center for Advancing Translational Sciences (National Institutes of Health Clinical and Translational Science Award-Programm, Zuschuss UL1 TR001866) und vom Shapiro-Silverberg Fund unterstützt Förderung der translationalen Forschung. PDB und MCN sind Forscher des Howard Hughes Medical Institute.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Fabian Schmidt, Yiska Weisblum

Labor für Retrovirologie, Rockefeller University, New York, NY, USA

Fabian Schmidt, Yiska Weisblum, Daniel Poston, Justin DaSilva, Fengwen Zhang, Eva Bednarski, Theodora Hatziioannou und Paul D. Bieniasz

Howard Hughes Medical Institute, The Rockefeller University, New York, NY, USA

Magdalena Rutkowska, Michel C. Nussenzweig & Paul D. Bieniasz

Labor für Molekulare Immunologie, Rockefeller University, New York, NY, USA

Alice Cho, Dennis J. Schaefer-Babajew, Christian Gaebler, Marina Caskey und Michel C. Nussenzweig

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PDB, TH, MCN, FS. und YW konzipierte, gestaltete und analysierte die Experimente. FS und YW konstruierten und führten die Selektions- und Neutralisierungsexperimente für rVSV/SARS-CoV-2 durch. FS, YW, MR, JDS und EB führten die Pseudotyp-Neutralisierungsexperimente durch. FS, TH und FZ konstruierten die Expressionsplasmide. AC führte eine Next-Generation-Sequenzierung durch. DP und FS führten eine bioinformatische Analyse durch. MC, CG und DJS-B. führte die klinischen Protokolle aus, rekrutierte Teilnehmer und verarbeitete Proben. PDB, TH, FS und YW haben das Manuskript mit Beiträgen aller Co-Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Theodora Hatziioannou oder Paul D. Bieniasz.

PDB hat von Pfizer, Inc. eine Vergütung für die Beratung zu mRNA-Impfstoffen erhalten.

Informationen zum Peer-Review Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Titration pseudotypisierter Viren auf 293T/ACE2cl.22-Zellen. Chimäre Spike-Pseudotypisierungsviren im oberen linken Feld wurden unter Verwendung der unveränderten SARS-CoV-2Δ19- und SARS-CoVΔ19-Spike-Proteinkonstrukte und eines 3-Plasmid-HIV-1-Pseudotypisierungssystems erstellt (siehe Methoden). Die anderen Panels zeigen die Titration von Pseudotypen, die mithilfe eines Furin-Spaltungsstellen-mutierten SARS-CoV-2Δ19-Spike-Proteins (R683G) und eines 2-Plasmid-HIV-1-Pseudotypisierungssystems abgeleitet wurden (siehe Methoden). b: Die gleichen pseudotypisierten Viren, die in (a) verwendet wurden, wurden verwendet, um drei verschiedene klonale 293T/ACE2-Zelllinien zu infizieren, die jeweils einen unterschiedlichen ACE2-Spiegel exprimierten (MFI = mittlere Fluoreszenzintensität). c, Titration von Pseudotypen, die ein unverändertes SARS-CoV-2Δ19-Spike-Protein und ein Furin-Spaltungsstellen-mutiertes SARS-CoV-2Δ19-Spike-Protein (R683G) tragen, erzeugt unter Verwendung eines 2-Plasmid-HIV-1-Pseudotypsystems (siehe Methoden). d, Vergleichende Neutralisationsstärke (NT50-Werte) von Rekonvaleszenzplasmen (RU27) mit hohem Titer gegen HIV-1-Pseudotypen, die R683G-mutierte (graue Symbole) und unveränderte (rote Symbole) SARS-CoV-2Δ19-Spike-Proteine tragen. Für alle Panels wird der Median ± Bereich zweier unabhängiger Experimente aufgetragen.

Quelldaten

a–c, Korrelationen der neutralisierenden Wirkungen der RU27-Plasmen gegenüber Psudotypen, die die angegebenen Paare von Spike-Proteinen tragen. Zur Berechnung der R2- und p-Werte wurde eine einfache lineare Regression verwendet. Die gestrichelten Linien geben 95 %-Konfidenzintervalle für die Regressionslinie an.

Häufigkeiten von Aminosäuresubstitutionen an jedem Codon des SARS-CoV-2-Spike-Proteins nach der angegebenen Anzahl von Passagen (P2-P6) von zwei unabhängigen rVSV-SARS-CoV-2-Populationen (1D7 und 2E1) in jedem der RU27 Plasmen, bestimmt durch NGS-Sequenzierung.

Infektion im Vergleich zu nicht neutralisierten Kontrollen durch Plaque-gereinigte rVSV/SARS-CoV-2-Isolate in Gegenwart der angegebenen Verdünnungen der angegebenen Plasmen aus dem RU27-Panel. Dieselben Plasmen, die zur Auswahl der angegebenen Mutanten verwendet wurden, wurden zur Bestimmung der Neutralisierungsstärke gegen die jeweiligen Plaque-gereinigten Mutanten (rot) und Elternviren (WT, grau) rVSV/SARS-CoV-2 1D7 oder 2E1 verwendet. Dargestellt ist der Median ± Bereich zweier technischer Replikate.

a, Design des polymutierten Spike-Proteins PMS1-1 mit 13 plasmaselektierten Spike-Mutationen, aggregiert in einem einzigen Spike. b, Infektion im Vergleich zu nicht neutralisierten Kontrollen durch rVSV/SARS-CoV2PMS1-1 (rot) und rVSV/SARS-CoV22E1 (grau) in Gegenwart der angegebenen Verdünnungen der Plasmen aus dem RU27-Panel. Dargestellt ist der Median ± Bereich zweier technischer Replikate.

a, Design der polymutierten Spike-Proteine PMS1-1 und PMSD4 mit 13 plasmaselektierten Spike-Mutationen, die in jedem Spike aggregiert sind. b, Schematische Darstellung von Mutationen in natürlich vorkommenden VOC/VOI-SARS-CoV-2-Spike-Proteinen.

a–c, Vergleichende Neutralisationsstärke (NT50-Werte) von zufälligem Plasma von Rekonvaleszenten (Ran1-21) und Impfstoffempfängern (Vac1-14) gegen WT (graue Symbole) und den angegebenen synthetischen SARS-CoV-2-Polymutanten (a), natürlich Variante (b) oder Sarbecovirus (c) (rotes Symbol) HIV-1-Pseudotypen. Für alle Panels wird der Median ± Bereich zweier unabhängiger Experimente aufgetragen.

Quelldaten

a–c, Vergleichende Neutralisationsstärke (NT50-Werte) von Rekonvaleszenzplasma (RU27) mit hohem Titer gegen WT (graue Symbole) und angegebene Polymutante (a), natürliche SARS-CoV-2-Variante (b) oder Sarbecovirus (c) (rotes Symbol). ) HIV-1-Pseudotypen. Für alle Panels wird der Median ± Bereich zweier unabhängiger Experimente aufgetragen.

Quelldaten

a, Neutralisationsstärke (NT50-Werte) von zufälligen Rekonvaleszenzplasmen (graue Symbole) oder ITV-Plasmen (rote Symbole) gegen SARS-CoV-2-Prototypen oder -Varianten oder Sarbecovirus-HIV-1-Pseudotypen. Dargestellt ist der Median zweier unabhängiger Experimente. Die gestrichelte Linie zeigt den mittleren NT50-Wert für zufällige Rekonvaleszenzplasmen gegen Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2. Die Zahlen über jedem Streudiagramm geben den mittleren NT50-Wert im Verhältnis zum mittleren NT50-Wert für Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2 an. b, Sequenzvielfalt über Sarbecovirus-Spike-Domänen hinweg; SARS-CoV-2 und die angegebenen Sarbecovirus-Spike-Sequenzen wurden mit Clustal abgeglichen und mit Simplot verglichen; Die prozentuale Identität relativ zu SARS-CoV2 wurde innerhalb eines rollierenden Fensters von 100 Aminosäuren aufgetragen.

An rVSV/SARS-CoV-2 angereicherte Substitutionen nach Selektion im neutralisierenden Plasma. Tabellierte SARS-CoV-2-Spike-Substitutionen und ihre Häufigkeiten in rVSV/SARS-CoV-2 nach der Passage in jeder der RU27-Plasmaproben.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schmidt, F., Weisblum, Y., Rutkowska, M. et al. Hohe genetische Barriere gegen das Entweichen polyklonaler neutralisierender SARS-CoV-2-Antikörper. Natur 600, 512–516 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-04005-0

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Eingegangen: 01. Juli 2021

Angenommen: 07. September 2021

Veröffentlicht: 20. September 2021

Ausgabedatum: 16. Dezember 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-04005-0

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