Membrantranslokationsprozess, der durch In-situ-Strukturen von Sekretinen des Typ-II-Sekretionssystems aufgedeckt wird

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4025 (2023) Diesen Artikel zitieren

1270 Zugriffe

7 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Eine Autorenkorrektur zu diesem Artikel wurde am 10. August 2023 veröffentlicht

Dieser Artikel wurde aktualisiert

Das GspD-Sekretin ist der äußere Membrankanal des bakteriellen Typ-II-Sekretionssystems (T2SS), das verschiedene Toxine absondert, die schwere Krankheiten wie Durchfall und Cholera verursachen. GspD muss von der inneren zur äußeren Membran wandern, um seine Funktion auszuüben, und dieser Prozess ist ein wesentlicher Schritt für den Aufbau von T2SS. Hier untersuchen wir zwei Arten von Sekretinen, die bisher in Escherichia coli entdeckt wurden: GspDα und GspDβ. Durch Elektronenkryotomographie-Subtomogramm-Mittelung bestimmen wir in situ-Strukturen der wichtigsten Zwischenzustände von GspDα und GspDβ im Translokationsprozess mit einer Auflösung im Bereich von 9 Å bis 19 Å. In unseren Ergebnissen zeigen GspDα und GspDβ völlig unterschiedliche Membraninteraktionsmuster und Arten des Übergangs der Peptidoglycanschicht. Auf dieser Grundlage stellen wir die Hypothese auf, dass es zwei unterschiedliche Modelle für die Membrantranslokation von GspDα und GspDβ gibt, die eine umfassende Perspektive auf die Biogenese von T2SS-Sekretinen von der inneren zur äußeren Membran bieten.

Sekretionssysteme, bei denen es sich um Proteinkomplexe in der Zellhülle von Bakterien handelt, werden von Bakterien genutzt, um virulenzbezogene Substrate zu produzieren, die das Überleben und die Pathogenität erleichtern1. Unter den Sekretionssystemen ist das Typ-II-Sekretionssystem (T2SS) in Proteobakterienarten weit verbreitet und funktionsfähig, einschließlich nicht-pathogener Escherichia coli (E. coli), enterotoxigener E. coli (ETEC), enteropathogener E. coli (EPEC) und Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae und Aeromonas hydrophila2. T2SS-Substrate in nicht pathogenen Bakterien können die Nährstoffaufnahme aus der Umwelt oder die Symbiose mit Pflanzen oder Tieren erleichtern, während T2SS-Substrate in pathogenen Bakterien die Adhäsion an Wirte unterstützen, Wirtszellen berauschen und die Immunität des Wirts unterdrücken können, was zu verschiedenen Krankheiten führt3. Aufgrund der vielfältigen Substratfunktionen und der großen Bedeutung von T2SS für Virulenz und Krankheiten ist die Kenntnis seiner Struktur und seines Wirkmechanismus erforderlich, um die Funktionen von Bakterien zu verstehen und antimikrobielle Strategien zu entwickeln.

Die äußere Membrankomponente von T2SS ist das Sekretin, das eine große Kanalstruktur bildet, eine Verbindung zum Proteingerüst auf der inneren Membran herstellt und den letzten Schritt des Substrattransports steuert2. Die phylogenetische Analyse von T2SS-Sekretinen aus Proteobakterienarten zeigte zwei Arten: die in Klebsiella und Dickeya vorkommenden Sekretine vom Klebsiella-Typ; und Sekretine vom Vibrio-Typ, die in Vibrio, ETEC und EPEC4 vorkommen. Strukturen der beiden Sekretintypen erscheinen beide als zylindrische Kanäle, die die N0-N3-Domänen, die Sekretindomäne mit einer zentralen Gate-Region und die S-Domäne enthalten5,6,7,8,9,10. Sie unterscheiden sich jedoch in der Transmembranregion: Die Sekretine vom Vibrio-Typ haben etwa 20 zusätzliche Aminosäuren zwischen den α7- und α8-Helices und bilden eine Schleife, die sich wie ein Dach nach oben und innen zur Mittelachse des Kanals erstreckt und ein Kappentor bildet. während Sekretine vom Klebsiella-Typ kein Cap-Gate haben5,6,7,8,9,10. Dies führt direkt zu Unterschieden in der Höhe der vorgeschlagenen Transmembranregionen der beiden Sekretintypen, was ihnen möglicherweise unterschiedliche Arten der Interaktion mit der Membran ermöglicht. Die In-situ-Struktur von T2SS wurde in Legionella pneumophila sichtbar gemacht, was auf die Architektur von T2SS und die Membraninteraktion des Sekretins hinweist11. Allerdings ist die Auflösung auf wenige Nanometer begrenzt, was die Beobachtung weiterer Details der Struktur erschwert. Die Untersuchung hochauflösender Strukturen von Sekretinen in situ könnte mögliche biologische Prozesse aufdecken, die in der zellulären Umgebung ablaufen, und ein umfassenderes Verständnis ihres Aufbauprozesses und ihrer Mechanismen ermöglichen. Diese Umgebung kann in vitro nicht genau simuliert werden und kann einen erheblichen Einfluss auf das Sekretinverhalten haben.

Die Translokation von T2SS-Sekretinen von der Innenmembran zur Außenmembran ist ein wesentlicher Schritt für den T2SS-Zusammenbau. Es ist jedoch noch unklar, wie diese Translokation in der bakteriellen Zellhülle reguliert wird. Basierend auf biochemischen Experimenten gibt es zwei mögliche Wege: (1) Die Gerüstproteine GspA und GspB binden und vergrößern die Porengröße von Peptidoglycan und verlagern das Sekretin zur äußeren Membran, wie es in den Klebsiella-Typ-Sekretinen ExeD und OutD zu finden ist12,13 ,14; (2) Ein kleines Pilotin GspS könnte an die S-Domäne von Sekretin binden, und das Pilotin selbst kann über den Lol-Sortierweg zur Außenmembran translozieren, wie er in den Sekretinen vom Vibrio-Typ zu finden ist4,15,16. Da einige T2SS ohne GspA und GspB oder das Pilotin11,17,18 existieren, existieren neben diesen beiden Signalwegen möglicherweise auch andere Signalwege. Trotz der aktuellen biochemischen Beweise konnte dieser Translokationsprozess in lebenden Zellen nicht sichtbar gemacht werden. Durch die Durchführung von In-situ-Elektronenkryotomographie-Studien (Kryo-ET) an T2SS-Sekretinen erfassen wir verschiedene Zwischenzustände während des Translokationsprozesses der Außenmembran, was dabei hilft, den Translokationsmechanismus zu erklären und eine klarere Blaupause für den Biogeneseprozess von T2SS-Sekretinen zu liefern.

Es gibt zwei T2SS-Sekretine, die in zwei T2SS-Operons im E. coli-Genom kodiert sind: das im T2SSα-Operon kodierte GspDα vom Klebsiella-Typ, das Chitinase19,20,21,22 sezernieren kann, was nicht-pathogene Funktionen darstellt; und das im T2SSβ-Operon kodierte GspDβ vom Vibrio-Typ4,15, das Toxine23,24 absondern kann, die pathogene Funktionen darstellen. In dieser Studie untersuchen wir die In-situ-Strukturen von GspDα aus dem Stamm E. coli K12 und GspDβ aus dem Stamm ETEC H10407 als Vertreter der Sekretine vom Klebsiella-Typ bzw. des Sekretins vom Vibrio-Typ. Wir berichten über vier In-situ-Strukturzustände spezifischer Sekretin/Sekretin-Pilotin-Komplexe, die in E. coli-Zellen mithilfe der Mittelung des Kryo-ET-Subtomogramms bestimmt wurden. Es handelt sich dabei um GspDα auf der Innenmembran, GspDα auf der Außenmembran, GspDβ-GspS-Komplex auf der Außenmembran und GspDβ auf der Innenmembran (Ergänzungstabelle 1). Zusammen zeigen diese Strukturen Wechselwirkungen von Sekretinen mit inneren und äußeren Membranen und geben Einblicke in den Biogeneseprozess des GspD-Sekretins.

Um dünne Zellen für einen verbesserten Kontrast unter Kryo-ET zu erhalten, verwendeten wir ein Bakterien-Minizellensystem, um dünne Zellen bereitzustellen, die physiologische Aktivitäten beibehalten25. Wir induzierten eine Überexpression von GspDα in E. coli BL21 (DE3)-Zellen (Abb. 1j). Zur Abbildung der Minizellen wurde Kryo-ET durchgeführt und es wurden 250 Neigungsserien gesammelt. Auf den rohen Neigungsbildern und den rekonstruierten Tomogrammen konnten Zellmerkmale einschließlich der intakten Bakterienzellhülle und membrangebundenen GspDα-Partikel deutlich erkannt werden (Abb. 1a – d). In den Tomogrammen konnten GspDα-Multimerpartikel in unterschiedlichen Orientierungen in Bezug auf die Gitterebene identifiziert werden, und überraschenderweise befinden sich die GspDα-Partikel unter diesen experimentellen Bedingungen natürlicherweise auf der Innenmembran der Bakterienhülle, wobei die Nicht-Transmembrandomänen ihr zugewandt sind periplasmatischer Raum (Abb. 1d). Da GspDα eine annähernd zylindrische Form hat, identifizierten wir die Partikel in der Draufsicht und Seitenansicht als Kreise bzw. als Paar gekrümmter Linien, die an der inneren Membran befestigt waren. Die Bilder von Negativkontrollzellen bestätigten weiter, dass diese in den Tomogrammen gefundenen Partikelmerkmale zu unserem interessierenden Protein gehören (ergänzende Abbildung 1).

a Die Tomogramm-Z-Schnittansicht von E. coli, das GspDα überexprimiert. b Segmentierung des in (a) gezeigten Tomogramms, wobei OM lila gefärbt ist, PG gelb gefärbt ist, IM dunkelrot gefärbt ist und GspDα auf IM blau gefärbt ist. c Vergrößern Sie das Tomogramm, z-Schnittansicht der GspDα-Partikel in der Draufsicht. d Vergrößern Sie die Z-Schnittansicht des Tomogramms von GspDα-Partikeln in der Seitenansicht, angezeigt durch weiße Pfeilspitzen mit blauer Umrandung. z. B. Tomogramm-z-Schnitte, die geneigtes GspDα auf der Innenmembran oder GspDα zeigen, bei dem nur eine Seite die Innenmembran verbindet (weiße Pfeilspitzen mit blauer Umrandung). Die äußere und innere Membran werden durch die violette Linie bzw. die dunkelrote Linie angezeigt. h Eine Tomogramm-z-Schnittansicht von E. coli, das GspDα überexprimiert und D-Methionin hinzugefügt hat (das GspDα-Partikel auf dem OM wird durch eine weiße Pfeilspitze mit grüner Umrandung angezeigt). i Segmentierung des in h gezeigten Tomogramms, wobei OM lila gefärbt ist, PG gelb gefärbt ist, IM dunkelrot gefärbt ist, GspDα auf IM blau gefärbt ist und GspDα auf OM grün gefärbt ist. j Immunblotting-Ergebnisse der GspDα-Überexpression unter Verwendung von Anti-His-Tag-Antikörpern. Als Kontrolle wurden BL21 (DE3)-Zellen (WT) ohne Plasmidtransformation verwendet. k, Innere und äußere Membranfraktionen der GspDα-überexprimierenden Zellen, die mit/ohne D-Methionin behandelt wurden, wurden durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation getrennt. Die Membranposition von GspDα wurde mit Anti-His-Tag-Antikörpern immungeblottet. l Äußere Membranproteine der GspDα-überexprimierenden Zellen, die mit/ohne D-Methionin behandelt wurden, wurden mit einem Bakterienmembranprotein-Extraktionskit extrahiert. Das Gesamt-GspDα und das Außenmembran-GspDα wurden durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-His-Tag-Antikörpern untersucht. Die Expressions- und Membranlokalisierungsexperimente von GspDα wurden dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. IM-Innenmembran, OM-Außenmembran, PG-Peptidoglycan, D-Met-D-Methionin, WT-Wildtyp. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Für die Subtomogramm-Mittelung wurden ca. 32.000 Partikel manuell ausgewählt und die Datenverarbeitung erfolgte mit EMAN226. In einer Reihe früherer In-vitro-Strukturen wurde bestätigt, dass Sekretin C15-Symmetrie aufweist5,7,9,27,28. Die Symmetrie von Sekretin in vivo wurde jedoch nicht bestätigt. Um die Symmetrie unserer Partikel zu bestätigen, haben wir einen Algorithmus zur Messung des Radius einzelner Partikel entwickelt und ein Histogramm erstellt, um nach möglichen Mehrfachradien zu suchen (ergänzende Abbildung 2). Das Histogramm zeigt nur einen Peak mit einem Durchmesser, der mit der C15-Struktur von GspDα (PDB: 5WQ7) übereinstimmt, was stark darauf hindeutet, dass es in situ nur einen Durchmesser von GspDα-Partikeln auf der inneren Membran gibt, der seiner C15-Struktur entspricht. Eine Herausforderung bei der Subtomogramm-Ausrichtung des Sekretins besteht darin, dass es aufgrund des Fehlens von Merkmalen mit niedriger Auflösung entlang der Symmetrieachse in der Anfangsphase der Orientierungsbestimmung schwierig ist, Partikel in der Draufsicht von Partikeln in der Unteransicht zu unterscheiden, ohne dass darüber Informationen vorliegen die Membranposition. Daher waren zu Beginn der Verfeinerung des Subtomogramms viele Partikel in der Draufsicht falsch ausgerichtet und auf dem Kopf stehend positioniert, was die endgültige Auflösung einschränkte und dazu führte, dass die ursprünglich rekonstruierte Karte einige „D“-symmetrische Merkmale (Symmetrie entlang der zentralen x-y-Ebene) aufwies ) zusätzlich zur 15-zähligen Symmetrie. Um diese Unklarheit zu beseitigen, haben wir im EMAN2-Tomographiepaket einen Algorithmus entwickelt, der die geometrische Lage der Zellmembran als zusätzlichen Faktor bei der Bestimmung der Partikelorientierung berücksichtigt (siehe „Methoden“). Die Verwendung dieser Methode verbesserte sowohl die sichtbaren Merkmale in der Karte als auch die gemessene Auflösung (ergänzende Abbildung 3b, c).

Der endgültige Durchschnitt des C15-symmetrischen Subtomogramms erreichte eine gemessene Auflösung von 9 Å (ergänzende Abbildung 4a), was durch eine gewisse Sichtbarkeit von Alpha-Helices in der Karte gezeigt wird (ergänzende Abbildung 5b, ergänzender Film 1). Die innere Membrandoppelschicht ist deutlich aufgelöst und am unteren Rand dieser Dichtekarte sichtbar. Über der inneren Membrandoppelschicht befindet sich das spulenförmige Protein (Zylinder mit größerem Durchmesser an beiden Enden) mit einer versiegelten, an die Membran angrenzenden Oberfläche und einer offenen, an die Membran angrenzenden Oberfläche. Die N0-N3-Domänen sind in der Dichtekarte deutlich zu erkennen (Ergänzende Abbildung 5b). In den N1- und N2-Domänen werden die beiden Schichten der Alpha-Helices gerade aufgelöst, was mit der gemessenen Auflösung der Karte übereinstimmt. Wenn die Position der N-Domänen identifiziert ist, kann die Transmembranregion von GspDα anhand der Länge der Sekretindomäne näherungsweise modelliert werden. Die Spitze von GspDα (α7–β11, β14 und der in der Membran vergrabene Bereich von β10 und β155) verläuft durch ein Blättchen der Lipiddoppelschicht, dringt jedoch nicht durch die Membran ein und erzeugt keine Öffnung in der Membran (ergänzende Abbildung 5b). Das versiegelte Ende des Zylinders entspricht der Gate-Region des Sekretins. Die Verbindungsdichte zwischen dem Protein und der inneren Membran scheint aufgrund der niedrigen Isoflächenschwelle, die für ihre Visualisierung erforderlich ist, sehr gering besetzt zu sein. Die Interpretation dieses Zusammenhangs erforderte daher einen gewissen Mehraufwand.

Da sowohl die Membran als auch die GspDα-Partikel im Rohtomogramm klar aufgelöst sind, konnten wir direkt beobachten, dass einige Partikel gegenüber der Membran leicht geneigt waren und nicht senkrecht zur Membran (Abb. 1e – g). Um die Membranverbindung von GspDα weiter zu bestätigen, haben wir mithilfe der C15-Dichtekarte und der entsprechenden Orientierungsinformationen jedes Partikels eine asymmetrische Struktur erzeugt, indem wir die Symmetrie gelockert haben (ergänzende Abbildung 3e, f) (siehe „Methoden“) und so eine Struktur erzeugt haben mit einer reduzierten Auflösung von 15 Å (Ergänzende Abbildung 5d). In dieser Dichtekarte sind die inneren Membranblätter wie erwartet immer noch aufgelöst und GspDα stellt die in der Mitte kontrahierte zylindrische Dichte dar. Die Membranverbindungsdichte ist nun bei scheinbarer Vollbelegung deutlich sichtbar, allerdings nur auf einer Seite des Zylinders. Die Membranverbindung deckt je nach Schwellenwert einen Bogen von etwa 100° ab, sodass GspDα bei der Bindung an die innere Membran nur teilweise verbunden ist. Wenn die C15-Symmetrie entlang der Zylinderachse angewendet wird, wird diese Teilverbindung gemittelt, was zu einer geringeren scheinbaren Belegung in der ursprünglichen symmetrischen Struktur führt (ergänzende Abbildung 5b).

Darüber hinaus führten wir eine gezielte Verfeinerung der Proteinregion unter Ausschluss der Membran durch und verglichen die Partikelorientierung mit der des integrierten Verfeinerungsergebnisses (ergänzende Abbildung 3g) (siehe „Methoden“). Anschließend kann für jedes Partikel der Orientierungsunterschied zwischen den beiden Verfeinerungen bestimmt werden. Durch die Klassifizierung dieser Unterschiede haben wir eine Flugbahn für GspDα auf der inneren Membran ermittelt, wo das Multimer um die Membrankontaktstelle schwingt (Zusatzfilm 2). Wir zeigen die Konformationen der beiden Endpunkte für diese Flugbahn (Abb. 2b, c): In Konformation A steht die Symmetrieachse von GspDα senkrecht zur Membran; und in Konformation B ist die Symmetrieachse von GspDα im Vergleich zu Konformation A um 2,86° geneigt.

a Die In-situ-Struktur von GspDα auf der Außenmembran, dargestellt in der zentralen Schnittansicht und in der Seitenansicht. Die Sekretin-, N3-, N2-, N1- und N0-Domänen sind mit gestrichelten Linien markiert. b, c Die In-situ-Strukturen der GspDα-Konformation A und der Konformation B auf der Innenmembran, dargestellt in der zentralen Schnittansicht und in der Seitenansicht. Dichtekarten werden durch die GspDα-In-vitro-Struktur (PDB: 5WQ7) angepasst. OM äußere Membran, IM innere Membran.

Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das GspDα-Multimer nicht in die bakterielle Innenmembran integriert ist. Stattdessen bildet es nur eine lose Verbindung mit erheblicher Beweglichkeit, die seinen weiteren Transport zur Außenmembran erleichtert (siehe „Diskussion“).

Wir nehmen an, dass sich das GspDα-Multimer auf der inneren Membran befindet, da das Peptidoglycan vorhanden ist, bei dem es sich um ein Netzwerk handelt, dessen Porengröße zu klein ist, als dass das GspDα-Multimer durch die äußere Membran gelangen und dort translozieren könnte. Wir haben versucht, die Peptidoglycan-Vernetzung zu reduzieren, um herauszufinden, ob dies das Targeting der äußeren Membran von GspDα erleichtern würde. In früheren Studien wurde bei Aeromonas hydrophila gezeigt, dass eine Verringerung der Vernetzung des Peptidoglycans durch Glycin das Sekretin ExeD an der Außenmembran lokalisieren könnte12,13. Biochemische Beweise zeigten auch, dass das Wachstum von E. coli in Medien mit einer hohen Konzentration an D-Methionin die Vernetzung des E. coli-Peptidoglycans29 verringert, zu dessen Mechanismus sowohl der Einbau von D-Methionin in die Muropeptide als auch D-Methionin gehört direkten Einfluss auf den Peptidoglycan-Remodelling. Daher züchteten wir E. coli-Minizellen in LB-Medium mit 40 mM D-Methionin, induzierten die Expression von GspDα und stellten fest, dass dies den Anteil von GspDα auf der Außenmembran im Vergleich zur Kontrolle erhöhte (Abb. 1k, l). In den Tomogrammen beobachteten wir GspDα-Partikel, die sich sowohl auf der Außenmembran als auch auf der Innenmembran befanden (Abb. 1h, i). Für die Subtomogramm-Mittelung haben wir nur Partikel auf der äußeren Membran ausgewählt. Es gab 309 Partikel, was zu einer endgültigen Verfeinerung mit C15-Symmetrie bei einer Auflösung von 16 Å führte (ergänzende Abbildung 4b). Innerhalb der Dichtekarte wird die äußere Membrandoppelschicht erneut mit einer angrenzenden spulenförmigen Dichte aufgelöst. Die an die Membran angrenzende Oberfläche des Zylinders ist versiegelt und zeigt den Anschnittbereich an. Die N0-, N1-, N2- und N3-Domänen konnten von der Membran distal zur membranangrenzenden Seite des Zylinders erkannt werden (Abb. 2a).

Um die Protein-Membran-Wechselwirkungen weiter zu untersuchen, haben wir die C15-Symmetrie wie zuvor für GspDα auf der Innenmembran gelockert. Die resultierende Dichtekarte, gesehen aus dem Querschnitt an der Membranverbindung, zeigt, dass GspDα anstelle der beobachteten einseitigen Verbindung mit einer gleichmäßigen Belegungsverteilung auf der Kontur des Zylinderumfangs mit der Membran verbunden ist (ergänzende Abbildung 5c). auf der inneren Membran (Ergänzende Abb. 5d). Um die Symmetrie von GspDα auf der äußeren Membran zu untersuchen, haben wir eine Verfeinerung vorgenommen, bei der nur C5-Symmetrie erzwungen wurde. Wenn die Struktur C15-Symmetrie aufweist, sollte sie drei Strukturwiederholungen innerhalb einer C5-Symmetrieeinheit aufweisen. Die resultierende Dichtekarte behält klare C15-symmetrische Merkmale bei (ergänzende Abbildung 5e), was die Symmetrie von GspDα in situ bestätigt. Zum Vergleich haben wir eine C5-Verfeinerung des GspDα im Datensatz der inneren Membran durchgeführt, und die resultierende Dichtekarte zeigte keine klaren C15-Merkmale (ergänzende Abbildung 5f). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Vergrößerung der Porengröße von Peptidoglycan durch Zugabe von D-Methionin bei der Aufzucht von E. coli die Translokation von GspDα zur Außenmembran ermöglicht, wo GspDα eine gleichmäßigere Konformation annimmt und eine gleichmäßig verteilte Verbindung mit der Membran bildet.

GspDβ hat als Homolog von GspDα eine ähnliche Struktur, mit Ausnahme eines zusätzlichen Cap-Gates auf der benachbarten Seite der Membran5,8, das unterschiedliche Transmembranregionen und Membranwechselwirkungen erzeugen kann. Außerdem verfügt GspDβ über einen anderen Mechanismus, der auf die äußere Membran abzielt. Anstatt Gerüstproteine zu verwenden oder die Porengröße des Peptidoglycans zu vergrößern, könnte ein kleines Protein GspS namens Pilotin an die S-Domäne von GspDβ binden und GspDβ zur äußeren Membran translozieren4,15. Um GspDβ-Partikel auf der Außenmembran sichtbar zu machen und zu überprüfen, ob GspS dort einen Komplex mit GspDβ bildet, haben wir zwei Experimente durchgeführt. Zum einen werden die GspDβ- und die GspS-Expression beide in Wildtyp-E. coli-Minizellen induziert, zum anderen wird nur die GspDβ-Expression in Wildtyp-E. coli-Minizellen induziert und die Proteinexpression wurde verifiziert (Abb. 3h). .

a Die Tomogramm-Z-Schnittansicht von E. coli, die GspDβ und GspS überexprimieren. b Die In-situ-Struktur des GspDβ-GspS-Komplexes auf der Außenmembran, wenn sowohl GspDβ als auch GspS überexprimiert sind, dargestellt in der Seitenansicht und der zentralen Schnittansicht. c, d Tomogramm-Z-Schnittansichten von E. coli, die nur GspDβ überexprimieren. e Die In-situ-Struktur des GspDβ-GspS-Komplexes auf der Außenmembran, wenn nur GspDβ überexprimiert wird, dargestellt in der Seitenansicht und der zentralen Schnittansicht. f Die Tomogramm-Z-Schnittansicht von ∆gspS E. coli, das GspDβ überexprimiert. g Die In-situ-Struktur des GspDβ-Multimers auf der inneren Membran, dargestellt in der Seitenansicht und der zentralen Schnittansicht. Partikel auf der äußeren und inneren Membran werden durch weiße Pfeilspitzen mit roter Umrandung bzw. weiße Pfeilspitzen mit gelber Umrandung angezeigt. Die Dichtekarten sind an die In-vitro-Struktur des GspDβ-GspS-Komplexes (PDB: 5ZDH) angepasst. Die Sekretin-, N3-, N2-, N1- und N0-Domänen sind mit gestrichelten Linien markiert. h Immunblotting-Ergebnisse der GspDβ- und GspS-Überexpression unter Verwendung von Anti-His-Antikörpern. Als Kontrolle wurden BL21 (DE3)-Zellen (WT) und BW25113-ΔgspS-Zellen (ΔgspS) ohne Plasmidtransformation verwendet. i Nachweis der Membranposition von GspDβ durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, gefolgt von Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-His-Tag-Antikörpern (die Bakterienstämme sind links markiert und alle Banden entsprechen GspDβ). Die Expressions- und Membranlokalisierungsexperimente von GspDβ wurden dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. IM-Innenmembran, OM-Außenmembran, WT-Wildtyp. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In den rekonstruierten Tomogrammen von GspDβ-GspS-exprimierten Zellen befinden sich alle Partikel auf der Außenmembran (Abb. 3a), was durch ein Membrantrennexperiment bestätigt wurde (Abb. 3i). Wir haben 514 Subtomogramm-Partikel eingepackt, und die Verfeinerung mit C15-Symmetrie erreichte eine Auflösung von 19 Å (ergänzende Abbildung 4c). Um die Symmetrie zu überprüfen, haben wir eine Verfeinerung mit angewendeter C5-Symmetrie durchgeführt. Die resultierende Dichtekarte zeigt weiterhin C15-Merkmale (ergänzende Abbildung 6a), was bestätigt, dass GspDβ in situ C15-Symmetrie aufweist. In der Dichtekarte (Abb. 3b) ist die äußere Membrandichte als oberste Schicht sichtbar. Unterhalb der äußeren Membran befindet sich die spulenförmige Dichte, ähnlich der von GspDα. Die an die Membran angrenzende Oberfläche des Zylinders ist dicht verschlossen und weist auf den Gate-Bereich hin. Bemerkenswert ist, dass eine zusätzliche Dichte in Form von 15 Klumpen zu sehen ist, die sich mit der Membran am Rand des Zylinders verbinden. Diese zusätzlichen Dichten gehören wahrscheinlich zu GspS, was darauf hindeutet, dass GspDβ auf der Außenmembran in einem Komplex mit GspS vorliegt. Die In-vitro-Struktur des GspDβ-GspS-Komplexes (PDB: 5ZDH) konnte gut in die Dichtekarte eingepasst werden, und entsprechend der Position der Membrandichte konnte die Transmembranregion bei α7–α10, β11–β14 und lokalisiert werden der in der Membran vergrabene Bereich von β10 und β155,8. Im Gegensatz zu GspDα, das nur ein Blättchen der Membran passiert, passiert GspDβ zwei Blättchen der Lipiddoppelschicht, wobei das zusätzliche Cap-Gate das äußere Blättchen der äußeren Membran berührt.

Wir gehen davon aus, dass sich in Zellen, in denen nur GspDβ exprimiert wird, Partikel auf der Außenmembran befinden, da im Stamm E. coli BL21(DE3) eine endogene Expression von GspS stattfinden sollte. Den Tomogrammen zufolge befinden sich die meisten Partikel auf der äußeren Membran (Abb. 3c), aber überraschenderweise sind einige Partikelseitenansichten auf der inneren Membran zu sehen (Abb. 3d), was durch ein Membrantrennexperiment bestätigt wurde (Abb. 3i). ). In diesem Datensatz wurden 910 Partikel ausgewählt, darunter eine Mischung aus Partikeln, die sich auf der äußeren und inneren Membran befinden. Nach einer Verfeinerungsrunde führten wir eine Multireferenzklassifizierung mit zwei um 180° gegeneinander gedrehten Referenzen durch, die zwei Partikelpopulationen mit einem Verhältnis von 723 Partikeln der äußeren Membran zu 187 Partikeln der inneren Membran ergab. Wir haben die 723 Partikel für die Verfeinerung mit C15-Symmetrie verwendet und eine Struktur mit einer Auflösung von 16 Å erreicht (Abb. 3e und ergänzende Abb. 4d). Es wurde auch eine Verfeinerung mit C5-Symmetrie durchgeführt, und die Dichtekarte zeigte C15-Merkmale (ergänzende Abbildung 6b). Diese Struktur ähnelt im Wesentlichen der des GspDβ-GspS-exprimierten Datensatzes (Abb. 3b), aber insbesondere ist die GspS-Dichte immer noch außerhalb des GspDβ-Kanals zu sehen und erscheint als Klumpen, die mit der Zylinderoberfläche verbunden sind, obwohl wir keine Überexpression von GspS induziert haben.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass GspS, wenn es zusammen mit GspDβ überexprimiert wird, einen Komplex auf der Außenmembran bildet. Ohne exogene GspS-Expression reicht bei der Expression von GspDβ das endogene GspS von E. coli aus, um GspDβ an der Außenmembran zu lokalisieren, wo GspS an GspDβ gebunden bleibt.

Da biochemische Ergebnisse gezeigt haben, dass GspDβ beim Ausschalten von gspS Multimere auf der Innenmembran bilden kann, haben wir zur Visualisierung von GspDβ auf der Innenmembran die Expression von GspDβ in ΔgspS-E.-coli-Zellen induziert (Abb. 3h). In den rekonstruierten Tomogrammen werden alle Partikel auf der inneren Membran sichtbar gemacht, wobei sich die nicht-transmembranen Domänen im Periplasma befinden (Abb. 3f, i). Es gibt 370 Partikel, und durch die Verfeinerung mit C15-Symmetrie wurde eine Struktur mit einer Auflösung von 14 Å erzielt (ergänzende Abbildung 4e), wodurch GspDβ auf der inneren Membran dargestellt wurde (Abb. 3g). Die Membrandichte könnte sich unten befinden, und die Zylinderdichte erscheint oben, eingefügt in die Membran. Die Abdichtung am unteren Ende des Zylinders entspricht dem Angussbereich. Das untere Ende von GspDβ verläuft durch zwei Blättchen der inneren Membran, und außerhalb der Zylinderdichte ist keine GspS-Dichte zu erkennen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich GspDβ beim Ausschalten von gspS selbst zu einem Multimer zusammenfügen könnte, das eine stabile Konformation auf der inneren Membran aufweist.

In dieser Studie zeigen wir die In-situ-Strukturen des GspDα-Sekretins aus bakteriellem T2SS und ihre Wechselwirkungen mit den inneren und äußeren Membranen. Wir zeigen, dass: (1) sich GspDα in seiner multimeren Form auf der Innenmembran selbst zusammensetzen könnte, ohne dass ein anderes Protein überexprimiert wird (Abb. 1d); (2) Das GspDα-Multimer bildet flexible Verbindungen mit der Innenmembran und erzeugt keine Öffnung auf der Innenmembran (Abb. 2b, c); (3) die ungestörte normale Peptidoglycan-Porengröße erlaubt nicht den Durchgang eines GspDα-Multimers30; (4) dissoziative GspDα-Multimere existieren im Periplasma von E. coli, die GspDα exprimieren, jedoch nur zwischen dem Peptidoglycan und der inneren Membran (ergänzende Abbildung 7a – c); (5) D-Methionin könnte die Peptidoglycan-Vernetzung reduzieren29 und die Zugabe von D-Methionin bei der Aufzucht von E. coli könnte GspDα an der Außenmembran lokalisieren (Abb. 1h); (6) dissoziative GspDα-Multimere existieren im Periplasma von E. coli, die mit D-Methionin gezüchtet wurden und GspDα exprimieren (ergänzende Abbildung 7d); (7) GspDα auf der Außenmembran liegt in einer stabileren Konformation vor, zeigt eine unterscheidbare Symmetrie und bildet gleichmäßig verteilte Verbindungen mit der Außenmembran (ergänzende Abbildung 5c, e). Insgesamt stützen diese Beweise ein Translokationsmodell, bei dem GspDα zunächst Multimere auf der inneren Membran bildet, wo es in einem instabilen und schwingenden Zwischenzustand verbleibt, was seinen Transport zur äußeren Membran begünstigen könnte. Wenn die Peptidoglycan-Pore durch D-Methionin vergrößert wird, wandert das Multimer ohne Zerlegung zur Außenmembran. Auf der äußeren Membran liegt es in einer konsistenten Konformation vor und ist fest mit der Membran verbunden, was möglicherweise den Substrattransport erleichtert (Abb. 4a). Bemerkenswerterweise befinden sich unseren Daten nach der Behandlung von E. coli-Zellen mit D-Methionin nicht alle GspDα-Partikel auf der Außenmembran. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass möglicherweise andere Wege oder Faktoren existieren, die die Translokation von GspDα zur Außenmembran unterstützen, wie beispielsweise die im T2SSα-Operon kodierten GspA- und GspB-Proteine. Wir erkennen an, dass die Ergebnisse des mit der inneren Membran verbundenen Zustands bei überexprimierten Bakterien beobachtet werden und die von uns beobachteten Zustände möglicherweise nicht das genaue Szenario darstellen, das in einer nicht manipulierten Bakterienzelle auftritt.

a Erstens bildet GspDα Multimere auf der inneren Membran und nimmt eine instabile und schwingende Konformation an, die zwischen Konformation A (hellblau) und Konformation B (dunkelblau) wechselt. Das Multimer konnte sich von der inneren Membran lösen und in das Periplasma eindringen (hellblaues Cartoon-Modell), aber es konnte nicht durch das Peptidoglycan gelangen und in die äußere Membran eindringen. Wenn die Porengröße des Peptidoglycans durch D-Methionin vergrößert wird, wandert das Multimer zur äußeren Membran, wo es in einer stabileren Konformation vorliegt (grün). b GspDβ bildet zunächst Multimere auf der inneren Membran (gelb); Dann nähert sich das Pilotin GspS (rosa), bindet das GspDβ-Monomer und transportiert es zur äußeren Membran. Auf der äußeren Membran fügt sich GspDβ wieder zu einem Multimer zusammen und GspS bleibt assoziiert und bildet einen GspDβ-GspS-Multimer-Komplex (hellrot). IM innere Membran, PG Peptidoglycan, OM äußere Membran, D-Met D-Methionin.

Wir beobachteten GspDβ-Multimerstrukturen sowohl auf der inneren als auch auf der äußeren Membran der Bakterien. Wir zeigen, dass: (1) wenn gspS in E. coli ausgeschaltet wird, GspDβ Multimere auf der inneren Membran bildet (Abb. 3f, g)4; (2) Wenn gspS in E. coli nicht ausgeschaltet oder überexprimiert wird, wird immer noch eine kleine Anzahl von GspDβ-Multimeren auf der inneren Membran gefunden (Abb. 3d); (3) die ungestörte normale Peptidoglycan-Porengröße erlaubt keinen Durchgang von GspDβ-Multimeren30; (4) Wenn GspS vorhanden ist, entweder aufgrund einer Vektorüberexpression oder einer endogenen Genomexpression, werden GspDβ-Multimere auf der Außenmembran gefunden (Abb. 3a, c), selbst wenn das Peptidoglycan ungestört ist; (5) GspS bindet im Verhältnis 1:1 an das GspDβ-Monomer8; (6) GspS selbst ist ein Lipoprotein, das über den Lol-Weg15 von der inneren zur äußeren Membran translozieren könnte; (7) wir beobachten keine dissoziierten GspDβ-Multimere im Periplasma; (8) GspDβ-Multimere auf der Außenmembran liegen in einem Komplex mit GspS vor, das heißt, GspS dissoziiert nach dem Transport von GspDβ zur Außenmembran nicht (Abb. 3b, e). Basierend auf unseren Beobachtungen würden wir ein Translokationsmodell vorschlagen, bei dem sich zunächst GspDβ selbst zu Multimeren auf der Innenmembran zusammensetzt und dann GspS auf der Innenmembran an GspDβ bindet, das in Monomere dissoziiert. GspS transportiert dann GspDβ zur äußeren Membran, wo sich GspDβ erneut mit assoziiertem GspS zu Multimeren zusammensetzt und einen GspDβ-GspS-Multimerkomplex bildet (Abb. 4b). Aufgrund der Einschränkungen der KryoET-Beobachtungen konnten wir den Prozess der Dissoziation von GspDβ-Multimeren auf der inneren Membran in Monomere und dem Eintritt in das Periplasma mit gebundenem GspS nicht direkt visualisieren. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um Beweise für diesen Vorgang zu liefern.

In unseren Strukturen ist die Transmembranregion von GspDα nur in einem Blättchen der Membran vergraben, anstatt die Membran zu durchdringen. Dieses Transmembranmuster ist unerwartet und wäre biophysikalisch unvernünftig, kann aber anhand unserer Kryo-ET-Strukturen deutlich beobachtet werden. Insbesondere wurde die In-situ-Struktur des gesamten T2SS sichtbar gemacht11 und es wurde darauf hingewiesen, dass das Sekretin von Legionella pneumophila, ein Sekretin vom Klebsiella-Typ basierend auf der phylogenetischen Sekretinanalyse4, auch nur ein Blättchen der Außenmembran durchdringt. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde vermutet, dass die Transmembranregion des Sekretins in vivo eine ausgedehntere Konformation aufweisen könnte. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um zu erklären, warum diese Membranwechselwirkung existieren könnte und welche In-vivo-Konformation diese Art von Transmembranmuster ermöglicht.

Beim Vergleich der Strukturen von GspDα und GspDβ in der inneren und äußeren Membran stellen wir fest, dass GspDα nur ein Blättchen der Lipiddoppelschicht durchquert, GspDβ jedoch beide Blättchen durchquert (ergänzende Abbildung 8). Dieser Unterschied könnte GspDβ zu einer höheren Effizienz beim Transport von Substraten verhelfen. Im E. coli-Genom gibt es zwei T2SS-Genoperons, T2SSα und T2SSβ. Während der Evolution kann T2SSβ durch Genduplikation des T2SSα-Operons erzeugt werden. Allerdings ist T2SSα endogen stummgeschaltet, während T2SSβ aktiv exprimiert und funktionsfähig ist15. Unser Ergebnis könnte eine mögliche Erklärung liefern, nämlich dass die möglicherweise höhere Effizienz des Substrattransports GspDβ einen Vorteil während der Evolution verschafft und es in vielen Bakterien zum bevorzugten und exprimierten T2SS macht.

Zusammenfassend haben wir vier In-situ-Strukturen des T2SS-Sekretins bestimmt: sowohl die innere als auch die äußere Membranstruktur von GspDα und GspDβ. GspDα liegt in instabiler Form auf der Innenmembran vor, geht aber feste und stabile Verbindungen mit der Außenmembran ein. Das GspDβ-Multimer liegt auf der Innenmembran von Wildtyp-E. coli vor, und GspDβ auf der Außenmembran liegt zusammen mit GspS vor. Zusammengenommen erweitern diese Ergebnisse das Wissen über die Membraninteraktionen der T2SS-Sekretine und ihren Targeting-Prozess auf die äußere Membran und liefern ein umfassendes Modell für den Sekretin-Biogeneseprozess von Proteobakterien.

Der Stamm E. coli BW25113-ΔgspS wurde vom Nara Institute of Science and Technology in Japan aus der Keio-Sammlung erhalten31,32. Der Stamm E. coli BL21 (DE3)-ΔgspS wurde von Ubigene Biosciences Co., Ltd. (Guangzhou, China) konstruiert. Die DNA-Sequenzen, die für GspDα (Stamm E. coli K12), GspDβ (Stamm ETEC H10407) und GspS (Stamm ETEC H10407) kodieren, wurden von General Biosystems Co., Ltd. (Anhui, China) synthetisiert. D-Methionin wurde von Sigma gekauft (Katalognummer: M9375-5G).

Das gspDα aus dem Stamm E. coli K12 ohne Tag oder mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag wurde in pETDuet-1 kloniert, was pETDuet-gspDα und pETDuet-gspDα-his ergab, die in E. coli BL21 (DE3) exprimiert wurden. jeweils. Der Vektor ohne Tag wurde für die Kryo-ET-Bildgebung verwendet und der Vektor mit dem Hexahistidin-Tag wurde zur Durchführung biochemischer Tests verwendet. Das gspDβ des Stamms ETEC H10407 mit Hexahistidin-Tag am C-Terminus wurde in pETDuet-1 eingefügt, was pETDuet-gspDβ-his ergab, das in E. coli Rosetta (DE3) exprimiert und für die Kryo-ET-Bildgebung verwendet und in E. coli exprimiert wurde. coli BL21 (DE3) für biochemische Experimente. Das Gen von gspS wurde in pETDuet-gspDβ-his mit einem Hexahistidin-Tag am C-Terminus kloniert, was pETDuet-gspDβ-his-gspS-his ergab, das in E. coli BL21 (DE3) exprimiert und für die biochemischen Experimente verwendet wurde. Das gspDβ mit Hexahistidin-Tag und das gspS ohne Tag vom Stamm ETEC H10407 wurden beide in die beiden Mehrfachklonierungsstellen von pETDuet-1 eingefügt, was pETDuet-gspDβ-his-gspS ergab, das in E. coli BL21 (DE3) exprimiert und für verwendet wurde Kryo-ET-Bildgebung. Das gspDβ des Stamms ETEC H10407 mit Hexahistidin-Tag wurde in pBAD eingefügt, was pBAD-gspDβ-his ergab, das im Stamm BW25113-ΔgspS exprimiert und für die Kryo-ET-Bildgebung verwendet wurde und im Stamm BL21 (DE3)-ΔgspS exprimiert und verwendet wurde für biochemische Experimente. Für Kryo-ET-Bildgebungsexperimente erhielten wir Minizellen durch Cotransformation der E. coli-Stämme mit pBS58, was die Häufigkeit der Zellteilung durch konstitutive Expression zellteilungsbezogener Gene erhöht33. Die erhaltene Minizellendicke liegt zwischen 130 und 250 nm. Als negative Kontrollzellen wurden E. coli-Zellen verwendet, die nur mit pBS58 und nicht mit irgendwelchen Proteinexpressionsvektoren transformiert waren.

Die Zellen wurden bei 37 °C in LB-Medium gezüchtet, das mit geeigneten Antibiotika (Endkonzentrationen 100 µg/ml Ampicillin und/oder 50 µg/ml Kanamycin) und bei Bedarf mit 40 mM D-Methionin ergänzt war. Die Proteinexpression wurde bei einer OD600 von 0,8 durch Zugabe von 0,5 mM IPTG oder 0,02 % Arabinose bei 20 °C über Nacht induziert. Die Proteinexpression wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-His-Tag-Antikörpern untersucht. Für Experimente mit GspDα wurden die Anti-His-Tag-Antikörper 10.000-fach verdünnt. Für Experimente mit GspDβ wurden die Anti-His-Tag-Antikörper 1000-fach verdünnt. Die Antikörper für das Kontroll-EF-Tu stammten aus früheren Veröffentlichungen34,35 und wurden 20.000-fach verdünnt.

Um eine Minizelltrennung durchzuführen, wurden E. coli-Kulturen zunächst 40 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert, um große Zellen auszufällen. Der Überstand wurde entnommen und 10 Minuten lang bei 20.000 × g zentrifugiert. Der Niederschlag wurde einmal mit PBS-Puffer gewaschen und dann auf eine OD600 von 10 resuspendiert. Die Zellen wurden mit 6 nm BSA-Referenzgold (Aurion) gemischt und dann wurden 3 µl der Mischung auf frisch glimmentladene, kontinuierliche Kohlenstofffolie aufgetragen Gitter (Quantifoil Cu R3,5/1 mit 2 nm durchgehendem Kohlenstofffilm, 200 Mesh). Unter Verwendung von Vitrobot Mark IV (FEI) wurden die Gitter 4 s lang mit Filterpapier abgetupft und in flüssiges Ethan getaucht. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff gelagert.

Alle Neigungsreihen wurden mit 5°-Winkelschritten von –50° bis +50°, Defokussierung von –1,5 bis –5 µm und einer Gesamtdosis von etwa 100 e−/Å2 erfasst. Für das GspDα im Datensatz der inneren und äußeren Membran wurde die Probe unter Verwendung des bidirektionalen Datenerfassungsschemas (Startwinkel –30°) auf einem 300-kV-FEI-Titan-Krios-Mikroskop mit einer Gatan K2 Summit-Direktelektronendetektorkamera unter Verwendung der SerialEM-Software abgebildet . Die Vergrößerung betrug 81.000-fach, mit einer Pixelgröße von 1,76 Å. Für die anderen Datensätze und den Kontrolldatensatz wurde die Probe mithilfe eines dosissymmetrischen Datenerfassungsschemas auf einem 200-kV-FEI-Glacios-Mikroskop mit einer Falcon 4-Direktelektronendetektorkamera unter Verwendung der Tomographiesoftware abgebildet. Die Vergrößerung betrug 92.000-fach, mit einer kalibrierten Pixelgröße von 1,52 Å (Ergänzungstabelle 1).

Die Rohbilder wurden von MotionCorr236 ausgerichtet. Die Neigungsreihenausrichtung, die Tomogrammrekonstruktion und die CTF-Korrektur wurden in EMAN226 durchgeführt. Für die Verfeinerung wurden 32.915 Partikel manuell aus 250 Tilt-Serien ausgewählt und mit einer Boxgröße von 256 extrahiert. Nach der Erstellung eines ersten Modells mit einer kleinen Menge von Partikeln, die ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, wurden 4 Iterationen der Subtomogramm-Verfeinerung durchgeführt durchgeführt. Die schlechtesten 20 % der Partikel wurden aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit der gemittelten Struktur ausgeschlossen.

Aufgrund der Form von GspDα sind die Draufsicht und die Unteransicht schwer zu unterscheiden, und nach der Verfeinerung waren viele Partikel in der Draufsicht um etwa 180° falsch ausgerichtet. Um dies zu korrigieren, wurde ein Algorithmus entwickelt, der auf der Grundlage aller in diesem Tomogramm aufgenommenen Partikel ein Zentrum für jedes Tomogramm bestimmt und einen Vektor von der Partikelposition zum Zentrum zeichnet (oder in die entgegengesetzte Richtung, wenn der Parameter „Invertieren“ aktiviert ist). Wenn die Ausrichtung eines Partikels aus dem Verfeinerungsergebnis nicht auf die gleiche Seite zeigt wie sein entsprechender Vektor, wird seine Ausrichtung um 180° gedreht. Nach der Korrektur wurde eine neue Partikelorientierungsdatei geschrieben und als Eingabe für die nächste Iteration der Verfeinerung verwendet. In den nächsten Iterationen wurde eine lokale Verfeinerung verwendet, um sicherzustellen, dass sich die Partikelorientierung nicht wieder in die falsche Richtung dreht. Und es wurden drei weitere Verfeinerungsschritte durchgeführt, um die endgültige Struktur zu erreichen.

Um die Partikelsymmetrie zu bestimmen, haben wir zunächst jedes Partikel basierend auf seiner Ausrichtung aus der Verfeinerung aufgestellt und auf 2D-Bilder projiziert und dann eine 2D-Klassifizierung in EMAN2 durchgeführt, aber das Ergebnis zeigte keine deutlich unterschiedlichen Klassen oder explizite Symmetrie. Wir haben auch eine Verfeinerung mit C12-, C14- und C16-Symmetrie vorgenommen, aber die resultierende Dichtekarte zeigte keine offensichtlichen Merkmalsunterschiede oder Merkmalsverbesserungen im Vergleich zur C15-Struktur. Um den Partikelradius zu messen, haben wir einen Tiefpassfilter auf das 2D-Projektionsbild des Partikels angewendet, die mittlere radiale Intensität entlang der radialen Achse berechnet und dann den Index aufgezeichnet, der dem maximalen Intensitätswert entspricht (ergänzende Abbildung 2). Der Partikelradius ist die Pixelzahl mal Angström pro Pixel.

Um den Membranverbindungsbereich von GspDα klarer darzustellen, haben wir eine fokussierte Klassifizierung durchgeführt und dabei eine Maske verwendet, die sich auf den Membranverbindungsbereich der Dichtekarte konzentriert (ergänzende Abbildung 3, gestrichelter Kasten). In den Ergebnissen gibt es eine Klasse, die C1-Merkmale aufweist (ergänzende Abbildung 3, rotes Linienfeld). Um diese C1-Struktur zu erreichen, haben wir eine Symmetriefreigabe unter Verwendung des gesamten Datensatzes durchgeführt: Bei unveränderter Ausrichtung der Symmetrieachse darf sich jedes Teilchen um die Symmetrieachse drehen und für eine Iteration nach einer am besten angepassten Symmetrieeinheit suchen, gefolgt von Mittelung von Subtomogrammen. Anschließend werden die Partikelorientierungen zwei Iterationen der Goldstandard-Verfeinerung unterzogen, wobei nur eine lokale Suche durchgeführt wird.

Wir haben in den Tomogrammen geneigte eingefügte Partikel beobachtet (Abb. 1e – g), was darauf hindeutet, dass für diese Partikel im Ausrichtungsprozess die Membrandichte und – wenn wir eine Referenzkarte angeben, bei der die Membran und die Partikelsymmetrieachse senkrecht stehen – Die Proteindichte konnte nicht gleichzeitig korrekt ausgerichtet werden. Wenn die Membrandichteebene korrekt ausgerichtet ist, ist die Ausrichtung der Proteindichte ungenau. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine gezielte Verfeinerung durchgeführt. Es wurde eine Maske erstellt, die den nicht-transmembranen Teil des Proteins umschließt, mit Ausnahme der Membrandichte, und eine Iteration der Ausrichtung wurde unter Verwendung der maskierten Struktur als Referenz durchgeführt (ergänzende Abbildung 3g). In dieser Iteration sollte der Proteindichteteil korrekt ausgerichtet sein. Anschließend haben wir die Orientierung der fokussierten Verfeinerung mit der der Gesamtverfeinerung verglichen, und der Orientierungsunterschied stellt den Neigungswinkel des Proteins dar. Der Orientierungsunterschied für jedes Partikel konnte aufgezeichnet und eine Flugbahn berechnet werden. Um die Bewegung darzustellen, wurde die gesamte Flugbahn in mehrere Intervalle unterteilt und für jedes Intervall wurden Klassendurchschnitte berechnet, die die entsprechende Konformation repräsentieren (ergänzende Abbildung 3h).

Der Datenverarbeitungsablauf für GspDα im Datensatz der äußeren Membran, GspDβ-GspS-Komplexdatensatz und GspDβ im Datensatz der inneren Membran ähnelt dem GspDα im Datensatz der inneren Membran, ist jedoch einfacher. Nach Bewegungskorrektur und Tomogramm-Rekonstruktion wurden Partikel aus Tomogrammen ausgewählt. Nach der Erstellung des ursprünglichen Modells erfolgte die Verfeinerung zunächst mit C15-Symmetrie für 4 Iterationen und anschließend wurden die Partikelorientierungen mithilfe der Zellmembrangeometrie korrigiert. Dann wurden weitere 4 Iterationen der lokalen Verfeinerung durchgeführt, um die endgültige Struktur zu erreichen (für C5-Verfeinerungen haben wir nur die Symmetrieeingabe auf C5 geändert, und andere Parameter waren gleich). Das Symmetriefreisetzungsprotokoll des GspDα im Datensatz der äußeren Membran folgte dem des GspDα im Datensatz der inneren Membran.

Äußere Membranproteine wurden mit einem Bakterienmembranprotein-Extraktionskit (BestBio) extrahiert. Kurz gesagt, E. coli-Zellen, die das Protein von Interesse exprimierten, wurden durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit PBS gewaschen und in Extraktionslösung A (enthaltend Proteaseinhibitormischung) suspendiert. Nach einstündigem Schütteln bei 4 °C wurde die Suspension 5 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 × g zentrifugiert, um das Pellet zu entfernen. Der Überstand wurde entnommen und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Danach konnte beobachtet werden, dass die Flüssigkeit in zwei Schichten aufgeteilt war. Die Flüssigkeit am Boden wurde als äußere Membranproteine gesammelt.

Die Trennung der inneren und äußeren Membranen durch isopyknische Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt37. Kurz gesagt, E. coli-Zellen, die das Protein von Interesse exprimierten, wurden durch Zentrifugation geerntet und in Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,5 M Saccharose; 10 mg/ml Lysozym; 1,5 mM EDTA) suspendiert. Nach 7-minütiger Inkubation auf Eis wurde die Suspension 10 Minuten lang bei 4 °C mit 10.000 × g zentrifugiert und dann das Pellet in Puffer B (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,2 M Saccharose; 1 M MgCl2) resuspendiert ) enthält RNase/DNase-Nuklease-Reagenz und Protease-Inhibitor-Cocktail. Die Mischung wurde durch Ultraschallbehandlung lysiert und 10 Minuten lang bei 4 °C und 6169 × g zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Anschließend wurde der Überstand durch Ultrazentrifugation bei 184.500 × g für 1 Stunde bei 4 °C pelletiert und dann in Puffer C (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) mit 20 % Saccharose suspendiert, um die gesamte Membranfraktion zu erhalten . Danach wurden Puffer C mit 73 % Saccharose und Puffer C mit 53 % Saccharose in ein 13-ml-Röhrchen (Beckman Coulter) geschichtet, beginnend am Boden, und schließlich wurden 0,5 ml der gesamten Membranfraktion oben geschichtet durch Puffer C, der 20 % Saccharose enthält, um das 13-ml-Röhrchen aufzufüllen. Dann wurden die Dichtegradienten 16 Stunden lang bei 4 °C und 288.000 × g zentrifugiert, und die gelbbraune Bande an der Grenzfläche zwischen 20 % und 53 % Saccharoseschichten und die weiße Bande an der Grenzfläche zwischen 53 % und 73 % Saccharoseschichten waren gesammelt als innere Membranfraktion bzw. äußere Membranfraktion.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Dichtekarten sind in EMDB mit den Zugangscodes EMD-29702 (GspDα auf der inneren Membran), EMD-29703 (GspDα auf der äußeren Membran), EMD-29698 (GspDβ auf der inneren Membran), EMD-29697 (GspDβ–GspS) hinterlegt auf der Außenmembran, exprimiert nur GspDβ) und EMD-29696 (GspDβ–GspS auf der Außenmembran, exprimiert GspDβ und GspS). Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt.

Alle relevanten Codes sind im EMAN2-Paket verfügbar.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40656-5

Costa, TRD et al. Sekretionssysteme in gramnegativen Bakterien: strukturelle und mechanistische Erkenntnisse. Nat. Rev. Microbiol 13, Nr. micro3456 (2015).

Artikel Google Scholar

Korotkov, KV, Sandkvist, M. & Hol, WGJ Das Typ-II-Sekretionssystem: Biogenese, molekulare Architektur und Mechanismus. Nat. Rev. Microbiol. 10, 336 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cianciotto, NP & White, RC Wachsende Rolle der Typ-II-Sekretion in der bakteriellen Pathogenese und darüber hinaus. Infizieren. Immun. 85, e00014–e00017 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dunstan, RA et al. Der Aufbau des Typ-II-Sekretionssystems, wie es in Vibrio cholerae vorkommt, hängt vom neuartigen Pilotin AspS ab. Plos Pathog. 9, e1003117 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yan, Z., Yin, M., Xu, D., Zhu, Y. & Li, X. Strukturelle Einblicke in den Sekretin-Translokationskanal im Typ-II-Sekretionssystem. Nat. Struktur. Mol. Biol. 24, 177–183 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hay, ID, Belousoff, MJ & Lithgow, T. Strukturelle Grundlagen der Interaktion des Typ-2-Sekretionssystems zwischen der inneren und äußeren Bakterienmembran. Mbio 8, e01344–17 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hay, ID, Belousoff, MJ, Dunstan, RA, Bamert, RS & Lithgow, T. Struktur und Membrantopographie des Vibrio-Typ-Sekretinkomplexes aus dem Typ-2-Sekretionssystem von enteropathogenen Escherichia coli. J. Bakteriol. 200, e00521–17 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yin, M., Yan, Z. & Li, Nat. Mikrobiol. 3, 581–587 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chernyatina, AA & Low, HH Kernarchitektur eines bakteriellen Typ-II-Sekretionssystems. Nat. Komm. 10, 5437 (2019).

Howard, SP et al. Struktur und Aufbau von Pilotin-abhängigen und -unabhängigen Sekretinen des Typ-II-Sekretionssystems. Plos Pathog. 15, e1007731 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ghosal, D. et al. In-vivo-Struktur des Sekretionssystems von Legionella Typ II mittels Elektronenkryotomographie. Nat. Mikrobiol. 4, 2101–2108 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanderlinde, EM, Strozen, TG, Hernández, SB, Cava, F. & Howard, SP Veränderungen in der Peptidoglycan-Vernetzung unterdrücken den Sekretin-Assemblierungsdefekt, der durch Mutation von GspA im Typ-II-Sekretionssystem verursacht wird. J. Bakteriol. 199, e00617–16 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanderlinde, EM et al. Der Aufbau des Typ-2-Sekretionssystems in Aeromonas hydrophila beinhaltet eine direkte Interaktion zwischen den periplasmatischen Domänen des Assemblierungsfaktors ExeB und des Sekretins ExeD. PloS ONE 9, e102038 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, S. et al. Das Gerüstprotein GspB/OutB erleichtert den Aufbau des Sekretionssystems von Dickeya dadantii Typ 2, indem es die Sekretinpore der äußeren Membran an der inneren Membran und an der Peptidoglycan-Zellwand verankert. Mbio 13, e00253–22 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Strozen, TG, Li, G. & Howard, SP YghG (GspSβ) ist ein neuartiges Pilotprotein, das für die Lokalisierung des GspSβ-Typ-II-Sekretionssystem-Sekretins von enterotoxigenen Escherichia coli erforderlich ist. Infizieren. Immun. 80, 2608–2622 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Konovalova, A. & Silhavy, TJ Biogenese von Lipoproteinen der Außenmembran: Lol ist nicht das Ende. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Wissenschaft. 370, 20150030 (2015).

Artikel Google Scholar

Gu, S., Shevchik, VE, Shaw, R., Pickersgill, RW & Garnett, JA Die Rolle der intrinsischen Störung und Dynamik beim Aufbau und der Funktion des Typ-II-Sekretionssystems. Biochim. Biophys. Acta 1865, 1255–1266 (2017).

White, RC & Cianciotto, NP Bewertung der Auswirkungen, Genomik und Entwicklung der Typ-II-Sekretion in einer großen, medizinisch wichtigen Gattung: dem Legionella-Typ-II-Sekretionsparadigma. Mikrob. Genom. 5, e000273 (2019).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Francetic, O. & Pugsley, AP Das kryptische Operon des allgemeinen sekretorischen Signalwegs (gsp) von Escherichia coli K-12 kodiert funktionelle Proteine. J. Bakteriol. 178, 3544–3549 (1996).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Francetic, O., Belin, D., Badaut, C. & Pugsley, AP Die Expression des endogenen Typ-II-Sekretionswegs in Escherichia coli führt zur Chitinase-Sekretion. Embo J. 19, 6697–6703 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

d'Enfert, C., Reyss, I., Wandersman, C. & Pugsley, AP Proteinsekretion durch gramnegative Bakterien. Charakterisierung von zwei Membranproteinen, die für die Pullulanase-Sekretion durch Escherichia coli K-12 erforderlich sind. J. Biol. Chem. 264, 17462–17468 (1989).

PubMed Google Scholar

d'Enfert, C., Ryter, A. & Pugsley, AP Klonierung und Expression der Klebsiella pneumoniae-Gene in Escherichia coli zur Produktion, Oberflächenlokalisierung und Sekretion des Lipoproteins Pullulanase. Embo J. 6, 3531–3538 (1987).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Horstman, AL & Kuehn, MJ Bakterielle Oberflächenassoziation von hitzelabilem Enterotoxin durch Lipopolysaccharid nach Sekretion über den allgemeinen Sekretionsweg. J. Biol. Chem. 277, 32538–32545 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, J., Baldi, DL, Tauschek, M., Strugnell, RA & Robins-Browne, RM Transkriptionelle Regulierung des yghJ-pppA-yghG-gspCDEFGHIJKLM-Clusters, der den Typ-II-Sekretionsweg in enterotoxigenen Escherichia coli kodiert. J. Bakteriol. 189, 142–150 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Farley, MM, Hu, B., Margolin, W. & Liu, J. Minicells, wieder in Mode. J. Bakteriol. 198, 1186–1195 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, M. et al. Ein vollständiger Datenverarbeitungsworkflow für Kryo-ET und Subtomogramm-Mittelung. Nat. Methoden 16, 1161–1168 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Korotkov, KV, Delarosa, JR & Hol, WGJ Eine dodecamerische ringartige Struktur der N0-Domäne des Typ-II-Sekretins aus enterotoxigenen Escherichia coli. J. Struktur. Biol. 183, 354–362 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reichow, SL, Korotkov, KV, Hol, WGJ & Gonen, T. Struktur des Choleratoxin-Sekretionskanals in seinem geschlossenen Zustand. Nat. Struktur. Mol. Biol. 17, 1226 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caparrós, M., Pisabarro, AG & Pedro, M. Ade Wirkung von D-Aminosäuren auf Struktur und Synthese von Peptidoglycan in Escherichia coli. J. Bakteriol. 174, 5549–5559 (1992).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, KC, Mukhopadhyay, R., Wen, B., Gitai, Z. & Wingreen, NS Zellform und Zellwandorganisation in gramnegativen Bakterien. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 105, 19282–19287 (2008).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baba, T. et al. Konstruktion von Einzelgen-Knockout-Mutanten im Leserahmen von Escherichia coli K-12: die Keio-Sammlung. Mol. Syst. Biol. 2, 2006.0008–2006.0008 (2006).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamamoto, N. et al. Update zur Keio-Sammlung von Escherichia coli-Einzelgen-Deletionsmutanten. Mol. Syst. Biol. 5, 335–335 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, B. et al. Visualisierung der Typ-III-Sekretsortierplattform von Shigella flexneri. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 112, 1047–1052 (2015).

Fu, X. et al. Das kleine Hitzeschockprotein IbpB fungiert in lebenden Zellen als robustes Chaperon, indem es seine vielfältigen Substratbindungsreste hierarchisch aktiviert*. J. Biol. Chem. 288, 11897–11906 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi, X. & Ezemaduka, AN Freisetzung von IbpB-gebundenem Substrat in lebenden Zellen, wie durch durch unnatürliche Aminosäuren vermittelte Photovernetzung gezeigt. FEBS Open Bio 10, 2081–2088 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, X. et al. Elektronenzählung und strahlinduzierte Bewegungskorrektur ermöglichen Einzelpartikel-Kryo-EM mit nahezu atomarer Auflösung. Nat. Methoden 10, 584–590 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cian, MB, Giordano, NP, Mettlach, JA, Minor, KE & Dalebroux, ZD Trennung der Zellhülle für gramnegative Bakterien in innere und äußere Membranfraktionen mit technischen Anpassungen für Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/60517 (2020).

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von R01GM143380 und R01HL162842, der Welch Foundation Q-2173-20230405 und Startkapital der BCM-BMB-Abteilung des ZW unterstützt; die National Natural Science Foundation of China (Nr. 82072312) und die Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (Nr. BK20211053) an XS; Postgraduierten-Forschungs- und Praxisinnovationsprogramm der Provinz Jiangsu (Nr. KYCX22_2925); und NIH R01GM080139 bis SJL CryoEM-Daten wurden am Baylor College of Medicine CryoEM ATC und am UTHealth CryoEM Core gesammelt, zu dem auch Geräte gehören, die mit Unterstützung des CPRIT Core Facility Award RP190602 erworben wurden. Wir danken Dr. Jun Liu und Dr. Bo Hu für die Bereitstellung des pBS58-Plasmids. Wir danken Hongjiang Wu für Diskussionen über Vektordesign und biochemische Experimente, Valerie Dalton für die Überarbeitung der Papiersprache und Snekalatha Raveendran für die Datensicherung.

Muyuan Chen

Aktuelle Adresse: Division of CryoEM and Bioimaging, SSRL, SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University, Menlo Park, CA, 94025, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Zhili Yu, Yaoming Wu.

Verna und Marrs McLean, Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Zhili Yu, Muyuan Chen, Tong Huo, Steven J. Ludtke und Zhao Wang

Schlüssellabor für Anästhesiologie der Provinz Jiangsu und Schlüssellabor für Anästhesie und Analgesieanwendung der Provinz Jiangsu, Medizinische Universität Xuzhou, Xuzhou, Jiangsu, 221004, China

Yaoming Wu, Wei Zheng und Xiaodong Shi

Cryo Electron Microscopy and Tomography Core, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Steven J. Ludtke & Zhao Wang

Abteilung für Molekular- und Zellbiologie, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Zhao Wang

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

ZW, XS und ZY haben Experimente entworfen. ZY führte das Einfrieren der Proben und die Kryo-ET-Bildgebung durch. ZY, MC und TH führten die Kryo-ET-Datenverarbeitung durch. YW und WZ führten biochemische Experimente durch. ZY hat die erste Arbeit geschrieben. ZW, XS, SJL, YW und MC haben das Papier überarbeitet.

Korrespondenz mit Xiaodong Shi oder Zhao Wang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yu, Z., Wu, Y., Chen, M. et al. Membrantranslokationsprozess, der durch In-situ-Strukturen von Sekretinen des Typ-II-Sekretionssystems aufgedeckt wird. Nat Commun 14, 4025 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39583-2

Zitat herunterladen

Eingegangen: 22. Februar 2023

Angenommen: 20. Juni 2023

Veröffentlicht: 07. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39583-2

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.