Antikörper-Feedback reguliert das Immungedächtnis nach SARS

Nature Band 613, Seiten 735–742 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Rückkopplungshemmung der humoralen Immunität durch Antikörper wurde erstmals im Jahr 1909 dokumentiert1. Nachfolgende Studien zeigten, dass Antikörper je nach Kontext Immunreaktionen verstärken oder hemmen können2,3. Allerdings ist wenig darüber bekannt, wie bereits vorhandene Antikörper die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen beeinflussen. Hier untersuchten wir die Gedächtnis-B-Zell-Reaktion bei Personen, die zwei hochaffine monoklonale Anti-SARS-CoV-2-Antikörper und anschließend zwei Dosen eines mRNA-Impfstoffs erhielten4,5,6,7,8. Wir fanden heraus, dass die Empfänger der monoklonalen Antikörper Antigen-bindende und neutralisierende Titer produzierten, die im Vergleich zu Kontrollpersonen nur geringfügig niedriger waren. Die Gedächtnis-B-Zellen der Personen, die die monoklonalen Antikörper erhielten, unterschieden sich jedoch von denen der Kontrollpersonen darin, dass sie überwiegend IgM-Antikörper mit niedriger Affinität exprimierten, die eine geringe Anzahl somatischer Mutationen trugen und konsistent eine veränderte Zielspezifität der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) zeigten mit Epitopmaskierung. Darüber hinaus neutralisierte nur einer von 77 getesteten Anti-RBD-Gedächtnisantikörpern das Virus. Der diesen Erkenntnissen zugrunde liegende Mechanismus wurde in Experimenten an Mäusen untersucht, die zeigten, dass die in Gegenwart derselben Antikörper gebildeten Keimzentren von B-Zellen mit niedriger Affinität dominiert wurden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass bereits vorhandene Antikörper mit hoher Affinität die Auswahl des Keimzentrums und der Gedächtnis-B-Zellen durch zwei unterschiedliche Mechanismen beeinflussen: (1) durch Senkung der Aktivierungsschwelle für B-Zellen, wodurch zahlreiche Klone mit geringerer Affinität an der Immunantwort teilnehmen können; und (2) durch direkte Maskierung ihrer zugehörigen Epitope. Dies könnte teilweise das sich verändernde Zielprofil von Gedächtnisantikörpern erklären, die durch Auffrischungsimpfungen hervorgerufen werden9.

Um zu untersuchen, wie die passive Verabreichung monoklonaler Antikörper die nachfolgenden humoralen Reaktionen auf die Impfung beim Menschen beeinflussen könnte, untersuchten wir eine Gruppe von 18 gesunden Freiwilligen, die eine Einzeldosis einer Kombination aus zwei langwirksamen monoklonalen Antikörpern gegen SARS-CoV-2 erhielten und anschließend erhielten zwei Dosen eines SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffs (Abb. 1a). Die beiden Antikörper – C144-LS und C135-LS – binden mit hoher Affinität an Epitope der Klassen 2 und 3 auf der RBD des SARS-CoV-2-Spike (S)-Proteins (Dissoziationskonstante (Kd) = 18 nM und Kd = 6). nM) und neutralisieren das Virus mit Werten der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) von 2,55 bzw. 2,98 ng ml−15,8.

a, Schematische Darstellung des Studiendesigns, mit Markierungen, die Wochen relativ zum Zeitpunkt der ersten Impfdosis angeben. mAb, monoklonaler Antikörper. b: Die Serumspiegel von C135-LS (oben, blau) und C144-LS (unten, rot) im Zeitverlauf werden angezeigt. Die dicken farbigen gestrichelten Linien zeigen die mittleren Serumkonzentrationen unter Empfängern monoklonaler Antikörper (n = 18) und die dünnen gepunkteten schwarzen Linien stellen einzelne Teilnehmer dar. Die beiden durchgezogenen vertikalen Linien geben den Medianwert an und die grau schattierten Bereiche geben den Zeitraum von der Verabreichung monoklonaler Antikörper bis zur Impfung an. c–f, Der halbmaximale Plasmabindungstiter (BT50) an RBD nach einer (Vax 1) und zwei Dosen (Vax 2) mRNA-Impfung für Empfänger monoklonaler Antikörper (n = 18, grün) und Kontrollen (n = 26, Blau). Jeder Punkt repräsentiert eine Person. Die gestrichelten horizontalen Linien stellen die mittlere Bindungsaktivität von Plasmaproben aus der Zeit vor der Pandemie von gesunden Personen dar, die als Negativkontrollen verwendet wurden. c,d, IgM- (c) und IgG-Bindungstiter (d) an WT-RBD. e, IgG-Bindung an R346S/E484K- (links) und N440K/E484K-RBDs (erweiterte Daten, Abb. 1). f, IgG-Bindung an NTD. g–i, Werte des halbmaximalen Neutralisierungstiters (NT50) im Plasma für Empfänger monoklonaler Antikörper (n = 18, grün) und Kontrollen (n = 26, blau) gegen HIV-1, pseudotypisiert mit SARS-CoV-2 WT S (g) , R346S/Q493K-Mutante S (h) und R346S/N440K/E484K-Mutante S (i) (Extended Data Abb. 2). Das S-Protein in den Pseudoviren in g–i enthielt eine R683G-Substitution. Die roten horizontalen Balken in c–i und die roten Zahlen in g–i stellen die Medianwerte dar. Die statistische Signifikanz von c–i wurde mithilfe zweiseitiger Mann-Whitney-U-Tests ermittelt, bei denen die Unterschiede zwischen Empfängern monoklonaler Antikörper und Kontrollen für jeden Zeitpunkt unabhängig verglichen wurden. P-Werte werden über den Diagrammen angezeigt. Alle Experimente wurden mindestens doppelt durchgeführt.

Zwischen dem 13. Januar und dem 3. März 2021 erhielten 23 SARS-CoV-2-naive Personen C144-LS und C135-LS (n = 21) oder Placebo (n = 2) in einer klinischen Phase-1-Studie zum ersten Mal am Menschen Rockefeller University Hospital (ClinicalTrials.gov: NCT04700163). Die Antikörper wurden modifiziert, um ihre Halbwertszeit zu verlängern, indem die Mutationen M428L und N343S in ihre Fc-Domänen10 (LS) eingeführt wurden. Einzelpersonen erhielten eine Einzeldosis C144-LS- und C135-LS-IgG1-Antikörper im Verhältnis 1:1, beginnend mit jeweils 100 mg subkutan (sc) in der Gruppe mit der niedrigsten Dosis und bis zu 15 mg pro kg intravenös (iv) in die Gruppe mit der höchsten Dosis. Die Teilnehmer wurden in Längsrichtung beobachtet, um die Sicherheit und Verträglichkeit der infundierten monoklonalen Antikörper zu beurteilen und ihre pharmakokinetischen Eigenschaften zu bestimmen.

Insgesamt 18 der 21 Teilnehmer der Phase-1-Studie, die die monoklonalen Antikörper erhalten hatten, entschieden sich für eine SARS-CoV-2-mRNA-Impfung und meldeten sich freiwillig zur Teilnahme an einer parallelen Beobachtungsstudie zur Bewertung ihrer Immunantworten auf die SARS-CoV-2-Impfung (Ergänzung). Tabellen 1 und 2). Die erste und zweite Impfstoffdosis wurden im Median 82 (Bereich 42–110) bzw. 103 (Bereich 70–131) Tage nach der Antikörperverabreichung verabreicht (Ergänzungstabellen 1 und 2). Zum Zeitpunkt der Impfung lagen die Plasmaspiegel von C144-LS und C135-LS je nach Dosierungsgruppe zwischen 5 und 100 µg ml−1 (Abb. 1b). Die geschätzten Halbwertszeiten von C144-LS und C135-LS betrugen 69–99 Tage bzw. 73–95 Tage.

Die 18 geimpften Antikörperempfänger wurden mit einer Kohorte von 31 zufällig ausgewählten mRNA-Impfstoffempfängern ohne Vorgeschichte einer Infektion verglichen9,11 (Abb. 1a und Ergänzungstabelle 1). In beiden Gruppen wurden 13–28 (Median: 19) bzw. 15–91 (Median: 29) Tage nach der ersten bzw. zweiten Impfdosis Proben entnommen. Die beiden Kohorten waren hinsichtlich der demografischen Merkmale und der Impfstoffformulierung relativ ähnlich (Ergänzungstabellen 1 und 2), und keine der in die Studie einbezogenen Personen serokonvertierte zu irgendeinem Zeitpunkt während des Beobachtungszeitraums zu Nukleokapsid (N), was darauf hindeutet, dass sie weiterhin infektionsnaiv waren.

Die Bindungsaktivität von Plasma-IgM- und IgG-Antikörpern gegen RBD wurde mit einem Enzymimmunoassay (ELISA) unter Verwendung von Wuhan-Hu-1 (Wildtyp (WT)) und mutierten Formen von RBD (R346S/E484K und N440K/E484K) gemessen Eliminieren Sie die Bindung durch C144 und C135, jedoch nicht durch Antikörper der Klasse 1 oder 4 oder durch einige affinitätsgereifte Antikörper der Klasse 2 oder 39,12 (Extended Data Abb. 1a–f). Bei der Messung der WT-RBD-Bindung nach einer oder zwei Impfstoffdosen unterschieden sich die IgM-Titer der Empfänger monoklonaler Antikörper nicht signifikant von denen der Kontrollen (Abb. 1c). Im Gegensatz dazu waren die IgG-Anti-WT-RBD-Titer bei Empfängern monoklonaler Antikörper im Vergleich zu den Kontrollen nach einer Impfstoffdosis signifikant höher, glichen sich jedoch nach der zweiten Dosis aus (Abb. 1d; P < 0,0001 bzw. P = 0,93). Der anfängliche Unterschied wurde auf die infundierten monoklonalen Antikörper zurückgeführt, da die Plasma-IgG-Antikörperspiegel in den Empfängerproben mit monoklonalen Antikörpern geringfügig waren, als dieselben Proben entweder gegen R346S/E484K- oder N440K/E484K-mutierte RBDs getestet wurden, die die C144- und C135-Bindung stören. wenn auch nicht signifikant, niedriger als die Kontrollen (Abb. 1e). Im Gegensatz dazu nahm der relative Beitrag endogener Anti-RBD-Antikörper mit der Zeit zu, was durch eine Abnahme der Korrelation zwischen den Serumspiegeln monoklonaler Antikörper und der Plasmabindung veranschaulicht wird (Erweiterte Daten, Abb. 1g, h).

Um festzustellen, ob die bereits vorhandenen Antikörper gegen RBD die humorale Immunität gegen unabhängige Domänen des SARS-CoV-2-S-Proteins beeinträchtigten, wurden dieselben Plasmaproben auf Bindung an die N-terminale Domäne (NTD) getestet. Die IgG-Titer des NTD waren bei den Empfängern und Kontrollen mit monoklonalen Antikörpern ähnlich (Abb. 1f). Wir kommen zu dem Schluss, dass hohe zirkulierende Konzentrationen von C144-LS und C135-LS die IgM-Anti-RBD-Antikörperreaktionen nicht beeinträchtigen und nur einen geringen Einfluss auf die IgG-Reaktionen haben. Daher beseitigen die infundierten Antikörper das Impfantigen nicht und beeinträchtigen auch nicht messbar dessen allgemeine Fähigkeit, eine Immunantwort hervorzurufen13.

Um die Plasmaneutralisierungsaktivität zu beurteilen, verwendeten wir mit WT pseudotypisiertes HIV-1 oder mutierte S-Proteine, die eine Mutation in der Furin-Spaltungsstelle (R683G) trugen14. Wie erwartet waren auf der Grundlage der Menge an C144-LS und C135-LS im Kreislauf die neutralisierenden Titer gegen den WT bei Empfängern monoklonaler Antikörper im Vergleich zu den Kontrollen zu beiden Zeitpunkten signifikant höher (Abb. 1g; P <0, 0001). Um den Beitrag der endogenen neutralisierenden Reaktion auf Epitope außerhalb der C144-LS- und C135-LS-Zielstellen zu bestimmen, verwendeten wir mit S-Proteinen pseudotypisierte Viren, die die Mutationen R346S/Q493K und R346S/N440K/E484K enthielten, die die neutralisierende Aktivität der zwei infundierte monoklonale Antikörper (Extended Data Abb. 2a – d). Trotz der anfänglichen Dominanz von Epitopen der Klassen 1–2 unter den neutralisierenden Antikörpern, die durch die mRNA-Impfung hervorgerufen wurden, war der neutralisierende Titer der Kontrollplasmen gegen die beiden mutierten Pseudoviren mit denen gegen den WT vergleichbar (Abb. 1h, i), was darauf hindeutet, dass ein signifikanter Anteil vorliegt der zirkulierenden endogenen neutralisierenden Antikörper sind von den Mutationen R346S/Q493K und R346S/N440K/E484K nicht betroffen. Nach der ersten Impfstoffdosis zeigten Empfänger monoklonaler Antikörper im Vergleich zu den Kontrollen deutlich niedrigere Neutralisierungstiter gegen die mutierten Pseudoviren (2,7-fach und 3,5-fach für R346S/Q493K und R346S/N440K/E484K; Abb. 1h,i; P = 0,0015). bzw. P = 0,014). In Übereinstimmung mit einem aktuellen Bericht13 verbesserte sich die neutralisierende Aktivität und unterschied sich nach der zweiten Impfstoffdosis nicht mehr signifikant von der der Kontrollen (Abb. 1h,i). Ebenso sahen wir keinen erkennbaren Unterschied in der Plasmaneutralisierung der antigenisch divergierenden BA.4/5-Variante, die in beiden Gruppen gleiche Immunevasion gegenüber den Plasmaantikörpern aufwies (Extended Data Abb. 2e). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Empfänger von C144-LS und C135-LS aufgrund der passiv verabreichten Antikörper zunächst hohe neutralisierende Aktivität im Serum aufwiesen und ihre eigenen neutralisierenden Antikörper entwickelten, die nach der mRNA-Impfung nicht empfindlich auf RBD-Mutationen in den C144/C135-Zielstellen reagierten .

Zusätzlich zu den Plasmazellen, die zirkulierende Antikörper produzieren, löst die Impfung auch Gedächtnis-B-Zellen aus, die zum Schutz nach erneuter Exposition gegenüber dem Erreger beitragen. Diese beiden Zelltypen werden durch unterschiedliche Mechanismen ausgewählt und daher weisen die von ihnen produzierten Antikörper unterschiedliche Affinitätsgrade zum Immunogen auf15,16,17. Obwohl die Rückkopplungseffekte von Antikörpern auf humorale Reaktionen seit 1909 eingehend untersucht wurden1,2 ist wenig über ihre Auswirkungen auf die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen bekannt. Um die Auswirkungen der Verabreichung passiver monoklonaler Antikörper auf B-Zell-Gedächtnisreaktionen beim Menschen zu untersuchen, verwendeten wir Durchflusszytometrie, um zirkulierende B-Gedächtniszellen zu zählen und zu reinigen, die an Phycoerythrin (PE) und Alexa-Fluor-647 (AF647) markierte RBDs5 (Extended) binden Daten Abb. 3a–c). Die mRNA-Impfung löste bei Empfängern monoklonaler Antikörper robuste RBD-spezifische Gedächtnis-B-Zell-Reaktionen aus, die nach der ersten bzw. zweiten Impfdosis etwa vier- bzw. dreifach höher waren als bei den Kontrollen (Abb. 2a; P < 0,0001 bzw. P < 0,0001). . Somit erhöht die Verabreichung von C144-LS und C135-LS das Ausmaß der Anti-RBD-Gedächtnis-B-Zell-Reaktion im Vergleich zu den Kontrollen.

a–c, Durchflusszytometrie-Zählung und Oberflächen-Immunglobulin-Expression von SARS-CoV-2-RBD-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen nach Vax 1 und Vax 2, isoliert aus Empfängern monoklonaler Antikörper (grün, n = 18) und Kontrollpersonen9,11 (blau) . n = 26 für Vax 1 und n = 31 für Vax 2 (a) und n = 10 (b und c). Jeder Punkt repräsentiert eine Person. Die roten horizontalen Balken (und die Zahlen in a) zeigen die Medianwerte. a, Die Anzahl der WT-RBD-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen pro 10 Millionen CD20+-B-Zellen (Erweiterte Daten Abb. 3a,b). b,c, Der Prozentsatz der Zellen unter den WT-RBD-bindenden CD20+-B-Zellen, die Zelloberflächen-IgG (b) oder IgM (c) exprimieren. d, Die Verteilung von Antikörpersequenzen, die aus Zellen stammen, die von fünf geimpften monoklonalen Antikörperempfängern nach Vax 2 isoliert wurden (Erweiterte Daten Abb. 4a–d). Die Zahlen in den inneren Kreisen geben die Anzahl der analysierten Sequenzen für die jeweilige Person an. Die grün gefärbten Scheiben zeigen klonal expandierte Zellen (gleiche IGHV- und IGLV-Gene, mit sehr ähnlichen CDR3s) innerhalb eines Individuums. Die Schnittgröße ist proportional zur Anzahl der klonal verwandten Sequenzen, wobei der Anteil der klonal erweiterten Sequenzen als Prozentsatz zusammengefasst wird (schwarze Umrandung). Die weißen Bereiche des Kreisdiagramms geben den Anteil der Sequenzen an, die nur einmal isoliert wurden. e, Der Anteil der Zellen, die IgG-Transkripte (schwarz) im Vergleich zu IgM-Transkripten (weiß) pro Person enthalten (siehe auch Erweiterte Daten Abb. 4e und Ref. 9,11). f,g, Somatische Hypermutation (SHM), dargestellt als kombinierte Nukleotidsubstitutionen (nt) der variablen Region der schweren und leichten Kette plus eine (IGVH + IGVL + 1), wobei jeder Punkt eine Sequenz von Empfängern monoklonaler Antikörper (grün) oder Kontrollen darstellt (Blau). Die Ringdiagramme unten zeigen den Anteil der Sequenzen ohne (IGVH + IGVL + 1 = 1) im Vergleich zu einer (IGVH + IGVL + 1 > 1) somatischen Hypermutation, und die eingekreisten Zahlen geben die Anzahl der für alle Zellen unabhängig analysierten Sequenzen an des Isotyps (f) und für IgM und IgG unabhängig analysiert (g). Die roten horizontalen Balken und Zahlen in f und g geben die Mittelwerte an. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe zweiseitiger Mann-Whitney-U-Tests (a–c und f), Kruskal-Wallis-Tests mit anschließender Dunn-Korrektur für Mehrfachvergleiche (g) und zweiseitigen exakten Fisher-Tests zum Vergleich von Brüchen (f und g) bestimmt ).

Menschliche Gedächtnis-B-Zellen stellen einen vielfältigen Zellpool dar, der sich in Keimzentren oder über einen extrafollikulären, vom Keimzentrum unabhängigen Weg entwickeln kann18,19,20. Gedächtnis-B-Zellen, die klassenvertauschte und stark somatisch mutierte Antikörper exprimieren, stammen hauptsächlich aus dem Keimzentrum19,21. IgM-exprimierende Gedächtnis-B-Zellen, die Antikörper exprimieren, die nur eine geringe Anzahl von Mutationen tragen, entwickeln sich typischerweise über einen vom Keimzentrum unabhängigen Weg22,23,24,25. Bei Kontrollpersonen machten IgG-exprimierende RBD-spezifische Gedächtniszellen zu beiden untersuchten Zeitpunkten den Großteil des Gedächtnis-B-Zellpools aus. Im Einklang mit dem Gesamtanstieg der Anti-RBD-Gedächtniszellen war die absolute Anzahl IgG-exprimierender Zellen bei Empfängern monoklonaler Antikörper geringfügig erhöht (Erweiterte Daten, Abb. 3d). Ihr relativer Beitrag war jedoch zu beiden Zeitpunkten deutlich reduziert und machte nur 30 % bzw. 45 % der RBD-spezifischen Zellen in Empfängern monoklonaler Antikörper nach einer bzw. zwei Dosen aus (Abb. 2b; P = 0,0002 und P < 0,0001). . In Übereinstimmung mit der relativen Abnahme der IgG+-Gedächtnis-B-Zellen waren mehr als die Hälfte (57 %) der RBD-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen von Empfängern monoklonaler Antikörper nach der ersten Impfstoffdosis positiv für Zelloberflächen-IgM, und dieser Wert sank nur geringfügig auf 49 %. nach der zweiten Impfdosis. Im Gegensatz dazu wurden zu diesem Zeitpunkt in der Kontrollgruppe nur wenige solcher Zellen gefunden (Abb. 2c und Extended Data Abb. 3e; alle P <0, 0001). Das verzerrte Isotypenverhältnis korrelierte mit der C144-Serumkonzentration zum Zeitpunkt der Immunisierung (Extended Data Abb. 3f – i). Wir kommen zu dem Schluss, dass bereits vorhandene hochaffine Anti-RBD-Antikörper die Immunantwort auf die SARS-CoV-2-mRNA-Impfung verändern und so die Entwicklung von IgM-exprimierenden B-Gedächtniszellen begünstigen.

Um weitere Einblicke in die Auswirkungen bereits vorhandener Antikörper auf die menschliche Gedächtnisreaktion auf die SARS-CoV-2-mRNA-Impfung zu gewinnen, haben wir nach der zweiten Impfdosis RBD-spezifische Gedächtnis-B-Zellen von fünf repräsentativen Empfängern monoklonaler Antikörper gereinigt (Extended Data Abb. 4a,b). Insgesamt wurden 353 bzw. 856 gepaarte Antikörpersequenzen von Empfängern monoklonaler Antikörper und zuvor charakterisierten Kontrollen untersucht (Abb. 2d, erweiterte Daten Abb. 4c – e und Ergänzungstabelle 3). IgM-Transkripte machten 70–94 % der von monoklonalen Antikörperempfängern gewonnenen Sequenzen aus, wobei durchschnittlich 9 % zu expandierten Klonen gehörten (Abb. 2d (oben) und 2e). Im Gegensatz dazu machten IgG-Transkripte mehr als 90 % der aus den Kontrollen isolierten Immunglobulinsequenzen aus (Abb. 2e und erweiterte Daten, Abb. 4e). Die relative IgM-Anreicherung war durch den empfindlicheren PCR-Assay stärker ausgeprägt und kann Zellen umfassen, die kein IgM mehr auf ihrer Oberfläche exprimieren. IgM-Gedächtniszellen, die aus dem extrafollikulären Nicht-Keimzentrum-Weg stammen, sind im Allgemeinen weniger somatisch mutiert als IgG-Gedächtniszellen, da sie weniger Teilungen durchlaufen19,25. In Übereinstimmung mit dieser Idee und dem umgekehrten Verhältnis von IgM- zu IgG-Gedächtnis-B-Zellen bei Empfängern monoklonaler Antikörper zeigten die von diesen Personen erhaltenen Antikörper im Vergleich zu den Kontrollen deutlich weniger somatische Mutationen (Abb. 2f; P < 0,0001). Beim unabhängigen Vergleich von IgM- oder IgG-Zellen unterschied sich die durchschnittliche Mutationslast jedoch nicht signifikant zwischen den Empfängern monoklonaler Antikörper und den Kontrollen (Abb. 2g; P > 0,99 und P = 0,40 für IgM bzw. IgG). Somit tragen IgM- und IgG-exprimierende B-Zellen in geimpften Personen, die C144-LS und C135-LS erhalten hatten, eine normale Anzahl somatischer Mutationen, aber das relative Verhältnis der beiden Gedächtniszelltypen ist umgekehrt, was den insgesamt niedrigeren Wert erklärt einer Mutation in ihrem Gedächtniskompartiment. Schließlich gab es im Gegensatz zu den Kontrollen keine Anreicherung der schweren Ketten VH3-53, VH1-69, VH1-46 und VH3-66, die häufig auf Epitope der Klassen 1 und 2 abzielen. Stattdessen kam es zu einer relativen Anreicherung der Gene VH3-9, VH5-51, VH4-39 und VH1-8 (Extended Data Abb. 4f). Die begrenzte Anzahl sequenzierter Zellen schließt endgültige Schlussfolgerungen über die genaue Klonotypverteilung in dieser Population aus, aber die relative Änderung der Häufigkeit der Verwendung von VH-Genen impliziert, dass die Rekrutierung von B-Zellen in das Gedächtniskompartiment von Empfängern monoklonaler Antikörper verändert ist. Zusammenfassend deuten die Daten darauf hin, dass bereits vorhandene Antikörper die zelluläre und molekulare Zusammensetzung des RBD-spezifischen MBC-Kompartiments verändern können, das sich als Reaktion auf die mRNA-Impfung entwickelt.

Um die Bindungs- und Neutralisierungsaktivität der Gedächtnisantikörper zu untersuchen, die durch die mRNA-Impfung bei C144-LS- und C135-LS-Empfängern hervorgerufen werden, haben wir 178 repräsentative monoklonale Antikörper hergestellt, die von fünf Personen als IgGs erhalten wurden, und sie auf Bindung an das WT SARS-CoV-2 getestet RBD mittels ELISA (Abb. 3a – c und Ergänzungstabelle 4). Im Gegensatz zu den Kontrollen, bei denen über 95 % der Gedächtnisantikörper stark an das RBD banden, zeigten monoklonale Antikörper, die von Freiwilligen isoliert wurden, die C144-LS und C135-LS erhielten, unterschiedliche Bindungsaktivitätsniveaus. Ungefähr ein Viertel (24 %) der Antikörper zeigte eine relativ schlechte Bindung, wobei die halbmaximalen wirksamen ELISA-Konzentrationen (EC50) nur geringfügig über unserer Nachweisgrenze lagen, und etwas mehr als ein Drittel (38 %) zeigte keine nachweisbare Bindung Bindung über dem Hintergrund (Abb. 3a,b). Dementsprechend war der Median (EC50) der von Empfängern monoklonaler Antikörper isolierten Antikörper signifikant höher als bei den Kontrollen (Abb. 3b; P < 0,0001). Bemerkenswerterweise blieb dieser Unterschied signifikant, wenn die aus IgM- und IgG-Gedächtniszellen isolierten monoklonalen Antikörper unabhängig voneinander analysiert wurden (Abb. 3c; P = 0,0005 bzw. P <0,0001).

a–c, Monoklonaler Antikörper, der an WT-RBD bindet. a: Die ELISA-Bindung von monoklonalen Gedächtnisantikörpern, die von monoklonalen Antikörperempfängern stammen, wird gezeigt. Jede Kurve repräsentiert einen Antikörper. Die grünen Kurven zeigen EC50-Werte von <10 µg ml−1; die grauen gestrichelten Linien zeigen EC50-Werte von >10 µg ml−1; Die durchgezogenen schwarzen Linien sind Antikörper, die kleiner oder gleich dem Anti-HIV1-Antikörper 3BNC117 der Negativkontrolle waren (dicke gelbe gestrichelte Linie). Als Positivkontrolle wurde C144 (dicke, rote gestrichelte Linie) verwendet. b, EC50-Werte abgeleitet von a für Empfänger monoklonaler Antikörper (grün) und Kontrollen (blau) für alle Antikörper, unabhängig vom Isotyp. c, EC50-Werte wie in b, aber IgM und IgG wurden unabhängig analysiert. Der grau schattierte Bereich zwischen den horizontalen gepunkteten Linien zeigt Antikörper mit EC50 > 10 µg ml-1 (schlechte Bindung) und nicht bindende Antikörper, willkürlich gruppiert bei 10 bzw. 20 µg ml-1. Die Ringdiagramme fassen den Anteil aller getesteten Antikörper für die jeweiligen Gruppen zusammen (eingekreiste Zahl). d, IC50-Werte für alle monoklonalen Antikörper, die aus geimpften monoklonalen Antikörperempfängern (grün) oder Kontrollpersonen (blau) isoliert wurden. Die Ringdiagramme veranschaulichen den Anteil nicht neutralisierender (nicht neutral; IC50 > 1.000 ng ml−1) Antikörper (schwarze Scheiben) unter allen für die jeweilige Gruppe getesteten Antikörpern (eingekreiste Zahl). e, IC50-Werte wie in d beschrieben, aber IgM- und IgG-Antikörper wurden unabhängig voneinander analysiert. f–l, Bindung monoklonaler Antikörper an monomeres und multimerisiertes Antigen durch BLI. f, Schematische Darstellung der Messungen der Monomerbindung, bei denen IgG auf dem Biosensorchip immobilisiert und anschließend dem Monomer-RBD ausgesetzt wurde (oben), und der multimeren Bindung unter Verwendung von 6P-stabilisierten WT-SARS-CoV-2-S-Proteintrimeren, die mit Streptavidin tetramerisiert wurden (unten). ). g, BLI-Spuren, erhalten unter monovalenten Bedingungen, wie in f (oben) gezeigt. Jede Kurve repräsentiert einen Antikörper. Die farbigen durchgezogenen Linien stellen die Bindung über dem Hintergrund dar, dargestellt durch den polyreaktiven Antikörper ED3835 (gepunktete schwarze Linie) und den Anti-HIV-1-Antikörper 3BNC117 (gestrichelte schwarze Linie). Die grauen Linien zeigen nicht bindende Antikörper. Als Positivkontrolle wurde C144 (dicke, rote gestrichelte Linie) verwendet. h, BLI-Spuren wie in g beschrieben für Antikörper, die in g keine messbare Bindung zeigten und anschließend unter polyvalenten Bedingungen auf Bindung getestet wurden, wie in f (unten) dargestellt. i: Der Prozentsatz bindender Antikörper unter monovalenten Bedingungen für alle Antikörper und nach Isotyp. Die Werte unter den Balken geben die Anzahl der getesteten Antikörper an. j, Der Prozentsatz der bindenden Antikörper, wie in i beschrieben, für die in h gezeigten Antikörper. k- und Kd-Werte, abgeleitet unter Monomerbindungsbedingungen in g für monoklonale Antikörperempfänger (grün) und Kontrollen (blau), unabhängig vom Isotyp. Die Ringdiagramme veranschaulichen den Anteil der getesteten Antikörper für die jeweilige Gruppe (eingekreiste Zahl), der messbar an monomeres RBD gebunden hat (Bindung, weiß) und denjenigen, für den kein Kd-Wert ermittelt werden konnte (kein Kd, schwarz). l, Kd-Werte wie in k beschrieben wurden unabhängig für IgM und IgG analysiert. m, Schematische Darstellung des BLI-Kompetitionsexperiments: (1) der Fängerantikörper mit bekannter Epitopspezifität (Klassenreferenzantikörper) wurde an den Biosensorchip gebunden; (2) dem Antigen ausgesetzt; und (3) der interessierende Antikörper wurde dem Chip hinzugefügt. n, Die Verteilung der angestrebten Epitope. Die Zahl in der Mitte gibt die Anzahl der getesteten Antikörper an. In Rot- und Blautönen gefärbte Scheiben stellen Epitope der Klassen 1, 2 und 3 oder kombinierte Epitope dar, und Grautöne stellen Epitope der Klasse 4 oder Epitope dar, die nicht klassifiziert werden konnten. Für b–e, k und l stellen die roten horizontalen Balken und Zahlen die Mittelwerte dar. ND, nicht bestimmt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe zweiseitiger Mann-Whitney-U-Tests (b, d und k), Kruskal-Wallis-Tests mit anschließender Dunn-Korrektur für Mehrfachvergleiche (c, e und l) und zweiseitigen exakten Fisher-Tests (d, e, k und l) und die zweiseitige χ2-Kontingenzstatistik (b, c und n).

Von C144-LS- und C135-LS-Empfängern erhaltene Gedächtnisantikörper, die mit EC50-Werten von <10 µg ml−1 an WT SARS-CoV-2 RBD banden, wurden auf neutralisierende Aktivität gegen mit WT S pseudotypisierte Viren getestet. Während fast zwei Drittel ( 63 %) der aus Kontrollen isolierten IgG- und 17 % der IgM-Antikörper zeigten messbare neutralisierende Aktivität, nur 1 von 45 IgG-abgeleiteten Antikörpern und keiner der 32 IgM-abgeleiteten Antikörper, die von C144-LS- und C135-LS-Empfängern erhalten wurden, neutralisierte SARS-CoV-2 (Abb. 3d,e). Somit zeigen die aus dem RBD-spezifischen Gedächtnis-B-Zellkompartiment von Empfängern geimpfter monoklonaler Antikörper isolierten Antikörper im Vergleich zu den aus den Kontrollen isolierten Antikörpern eine deutlich geringere neutralisierende Aktivität. Bei den im Umlauf befindlichen IgM-Antikörpern handelt es sich um Pentamere, die zusätzlich zu ihrer überlegenen Fähigkeit, Komplement zu fixieren, erhöhte scheinbare Affinitäten aufweisen. Um zu testen, ob die Bindungs- und Neutralisierungseigenschaften von IgM-Antikörpern verbessert würden, wenn sie als Pentamere exprimiert würden, exprimierten wir 17 IgM-Gedächtnisantikörper (15 von monoklonalen Antikörperempfängern und 2 von Kontrollen) als pentamere IgMs. Obwohl die von monoklonalen Antikörperempfängern erhaltenen Pentamere durch ELISA eine deutlich verbesserte Bindung an RBD zeigten (Extended Data, Abb. 5a und Ergänzungstabelle 4; P = 0, 0004), konnten sie weiterhin nicht neutralisieren (Extended Data, Abb. 5b und Ergänzungstabelle 4). Im Gegensatz dazu zeigten beide Kontroll-IgM-Antikörper eine verbesserte neutralisierende Wirkung, wenn sie als Pentamere exprimiert wurden (Extended Data Abb. 5b).

Um die Affinität der Antikörper zu untersuchen, führten wir Biolayer-Interferometrie-Experimente (BLI) durch, bei denen monoklonale Antikörper auf dem Biosensor-Chip immobilisiert und WT-RBD-Monomeren ausgesetzt wurden (Abb. 3f, g). Im Gegensatz zu den von den Kontrollpersonen stammenden Antikörpern, bei denen 96 % der getesteten Antikörper messbare Affinitäten aufwiesen, war dies nur bei zwei Dritteln (67 %) der von monoklonalen Antikörperempfängern stammenden Antikörpern der Fall (Abb. 3g, i, k; P < 0,0001). Wenn alle Antikörper zusammen betrachtet wurden, unterschied sich die mittlere Affinität (Affinitätskonstante (Kd)) zwischen Empfängern monoklonaler Antikörper und den Kontrollen um fast eine Größenordnung (Abb. 3k; P < 0,0001). Darüber hinaus blieb dieser Unterschied signifikant, wenn monoklonale IgM- und IgG-Antikörper unabhängig voneinander betrachtet wurden (Abb. 3l; P = 0,0058 bzw. P <0,0001). Überwiegen von IgM.

C144-LS und C135-LS haben das Potenzial, in vivo Immunkomplexe mit dem Impfstoffantigen zu bilden und es als Multimer zu präsentieren, das durch Aviditätseffekte die scheinbare Affinität einer B-Zelle für das multimerisierte Antigen erhöhen könnte. Um zu bestimmen, ob von Gedächtniszellen abgeleitete Antikörper von Empfängern monoklonaler Antikörper ohne offensichtliche Affinität zum monomeren Antigen eine Bindung unter Bedingungen höherer Valenz zeigen würden, setzten wir die immobilisierten monoklonalen Antikörper Biotin-Streptavidin-tetramerisierten Trimeren von S aus (Abb. 3f, h, j). ). Von den 25 getesteten Antikörpern ohne offensichtliche Monomerbindung banden 23 (92 %) an multimerisiertes S (Abb. 3h, j). Wir kommen zu dem Schluss, dass die meisten Anti-RBD-Antikörper, die aus monoklonalen Antikörperempfängern isoliert wurden und keine nachweisbare Bindung an RBD-Monomere zeigten, an multimerisiertes Antigen binden. Somit ist das Fehlen einer Bindung an das Monomerantigen eine Folge der relativ geringen Affinität der Gedächtnisantikörper, die von Empfängern monoklonaler Antikörper stammen, und nicht eine Folge einer veränderten Spezifität.

Um die Epitope zu untersuchen, auf die die durch den Impfstoff ausgelösten Anti-RBD-Antikörper abzielen, die von Gedächtnis-B-Zellen von C144-LS- und C135-LS-Empfängern produziert werden, führten wir BLI-Experimente durch, bei denen ein vorgefertigter Antikörper-RBD-Komplex einen von vier strukturell charakterisierten Antikörpern umfasste8,26 ,27 wurde einem zweiten monoklonalen Antikörper ausgesetzt, der auf ein unbekanntes Epitop abzielte (Abb. 3m und erweiterte Daten Abb. 6). Insgesamt 49 % der aus geimpften Kontrollen gewonnenen Anti-RBD-Gedächtnisantikörper zielen auf Epitope der Klassen 1, 2 oder 3 oder Kombinationen davon9,11 (Abb. 3n und erweiterte Daten Abb. 6a–f). Im Gegensatz dazu zielten nur 20 % der Gedächtnisantikörper, die von Empfängern monoklonaler Antikörper erhalten wurden, auf Epitope der Klasse 1 oder 2, und keines war Klasse 3-spezifisch. Stattdessen stellten wir fest, dass 78 % dieser Antikörper entweder auf Klasse-4-haltige Epitope oder auf Epitope abzielten, die mit unserer Methode nicht klassifiziert werden konnten (Abb. 3n und erweiterte Daten, Abb. 6a – f). Daher gab es im Vergleich zu den Kontrollen eine signifikante Verschiebung in der Verteilung der Epitope, auf die Gedächtnisantikörper aus monoklonalen Antikörperempfängern abzielten (Abb. 3n; P = 0, 0089). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass C144-LS und C135-LS die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen, die Anti-RBD-Antikörper exprimieren, und ihre Epitop-Zielpräferenz verändern.

Um den Mechanismus zu untersuchen, durch den bereits vorhandene Antikörper die Selektion von Gedächtnis-B-Zellen verändern, haben wir WT C57BL/6-Mäuse, die mit C135 und C144 oder einem irrelevanten monoklonalen Anti-HIV-Antikörpercocktail vorinfundiert wurden, mit rekombinantem SARS-CoV-2 RBD immunisiert (Abb. 4a). Mäuse, die mit Kontroll-Anti-HIV-Antikörpern vorbehandelt wurden, entwickelten Keimzentrumsreaktionen, bei denen durchschnittlich 27 % der B-Zellen an RBD banden (Abb. 4b, c und erweiterte Daten Abb. 7a – d). Obwohl sich die Größe des Keimzentrums bei Mäusen, die C135 und C144 erhielten, nicht veränderte (Abb. 4b und erweiterte Daten, Abb. 7c), war der Anteil der RBD-bindenden Zellen signifikant verringert (Abb. 4c und erweiterte Daten, Abb. 7b, d; P = 0,041).

a, Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Gepoolte popliteale Lymphknoten (dLN) wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert (Extended Data Abb. 7 und Methoden). b,c, Zählung der Keimzentrum-B-Zellen (CD38−FAS+GL7+) als Anteil aller B220+-B-Zellen (b) und RBD-bindenden Zellen als Anteil der Keimzentrum-B-Zellen (GCB) (c). d,e, Antikörpersequenzen aus einzelnen Keimzentrums-B-Zellen. d, Die Verteilung der Antikörpersequenzen. Die eingekreisten Zahlen geben die Anzahl der pro Tier analysierten Sequenzen an. Durchgezogene Kreisdiagrammscheiben zeigen klonal erweiterte Sequenzen an, wobei in Blautönen (Kontrollen) oder Grüntönen (monoklonale Anti-RBD-Antikörpergruppe) gefärbte Scheiben auf Bindungsklone hinweisen (Erweiterte Daten, Abb. 7b und Ergänzungstabelle 5). Die grauen Scheiben kennzeichnen nicht bindende Klone. Nur einmal vorkommende Sequenzen sind gepunktet (verbindlich) oder weiß (unverbindlich). e, Der relative Beitrag der Bindungsklone und Singuletts in d. f–i, Bindung monoklonaler Fab-Fragmente aus B-Zellen des Keimzentrums an monomeres RBD, bestimmt mit BLI. f, Der BLI-Aufbau. g,h, Spuren von Fab-Fragmenten, die von Kontrollen (g) und mit Anti-RBD behandelten Mäusen (h) stammen. Jede Kurve repräsentiert einen Fab. Die farbigen durchgezogenen Linien stellen die Bindung über dem Hintergrund dar, dargestellt durch den polyreaktiven Antikörper ED3835 (gestrichelte schwarze Linie) und den negativen Kontrollantikörper mGO53 (gepunktete schwarze Linie). Die grauen Linien zeigen nicht bindende Antikörper. Als Positivkontrolle wurde C144 (dicke, rot gestrichelte Linie) verwendet. i, Der Prozentsatz der bindenden Fab-Fragmente, wobei die Gesamtzahl der getesteten Fab-Fragmente aus der Kontrollgruppe (n = 47) und der monoklonalen Anti-RBD-Antikörpergruppe (n = 46) unten angegeben ist. Für b–i sind Kontrollmäuse, die mit irrelevanten monoklonalen Anti-HIV-Antikörpern (3BNC117 und 10-1074, n = 6) vorbehandelt wurden, in Blau dargestellt, und Mäuse, die eine Kombination aus C135 und C144 (n = 6) erhielten, sind in Grün dargestellt . Für b, c und e stellen die farbigen Punkte einzelne Mäuse dar und die roten horizontalen Linien geben die Mittelwerte an. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe zweiseitiger Mann-Whitney-U-Tests (b, c und e) und zweiseitiger exakter Fisher-Tests (i) bestimmt.

Um die molekulare Natur der Gedächtnisantikörper zu untersuchen, die in Gegenwart bereits vorhandener hochaffiner Antikörper produziert werden, haben wir Antikörper aus B-Zellen des Keimzentrums geklont und hergestellt. Insgesamt wurden 351 bzw. 352 Antikörper aus den mit Anti-RBD behandelten und mit Anti-HIV behandelten Kontrollgruppen erhalten (Ergänzungstabelle 5). Aus beiden Gruppen isolierte B-Zellen zeigten ein ähnliches Ausmaß an somatischer Mutation (Extended Data, Abb. 7e) und klonaler Expansion (Abb. 4d und Extended Data, Abb. 7f). Allerdings wurden bei den C135- und C144-Empfängern klonal expandierte und einzigartige B-Zellen von Zellen dominiert, die nicht an die RBD banden, wie mittels Durchflusszytometrie bestimmt (Abb. 4d, e; P = 0,046 bzw. P = 0,026).

Insgesamt 106 monoklonale Antikörper wurden als Fragment-Antigen-bindende (Fab) Fragmente exprimiert (Ergänzungstabelle 6) und durch BLI auf Bindung an SARS-CoV-2 RBD getestet (Abb. 4f). Unter Monomerbindungsbedingungen banden 46 % (22 von 47) der von den Kontrollmäusen stammenden Fab-Fragmente an das RBD (Abb. 4g). Im Gegensatz dazu zeigten nur 21 % (8 von 46) der Keimzentrum-B-Zell-Antikörper der mit C135 und C144 vorbehandelten Mäuse unter diesen Bedingungen eine messbare, aber nachweislich geringere Affinität (Abb. 4g – i; P = 0,0036 und erweitert). Daten Abb. 7g). Unsere Mausimmunisierungsexperimente zeigen also, dass bereits vorhandene hochaffine Antikörper die Affinitätsschwelle für die Beteiligung von B-Zellen an Immunantworten senken und liefern damit eine mechanistische Erklärung für die Beobachtung, dass das mit C135 und C144 infundierte Gedächtniskompartiment bei Menschen dominiert wird B-Zellen mit geringer Affinität.

Unsere Experimente zeigen, dass bereits vorhandene Antikörper die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen als Reaktion auf die SARS-CoV-2-mRNA-Impfung beim Menschen verändern. In Übereinstimmung mit einem aktuellen Bericht störten C144-LS und C-135-LS die Entwicklung zirkulierender Antikörper, die an Epitope außerhalb der Zielstellen der beiden monoklonalen Antikörper binden, nicht wesentlich13. Darüber hinaus stellten wir zwar fest, dass die endogenen neutralisierenden Reaktionen bei Empfängern monoklonaler Antikörper nach einer Dosis verringert waren, dieser Unterschied war jedoch nach zwei Dosen der mRNA-Impfung nicht mehr signifikant. Im Gegensatz dazu war die Entwicklung von Anti-RBD-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen tiefgreifend verändert. Insbesondere wurde die Affinitätsschwelle für den Eintritt in das B-Zellkompartiment des Gedächtnis- und Keimzentrums bei Menschen und Mäusen gesenkt, und es kam zu einer Veränderung der Epitope, auf die bei Vorhandensein bereits vorhandener Antikörper abgezielt wurde.

Gedächtniszellen, die IgG-Antikörper exprimieren, die spezifisch für Epitope der Klasse 1, 2 oder 3 sind, dominieren normalerweise die Anti-RBD-Reaktion nach 2 Dosen mRNA-Impfung4,5,6,7,8. Im Gegensatz dazu stellten wir fest, dass Empfänger monoklonaler Antikörper eine erhöhte Anzahl von IgM-Anti-RBD-Gedächtniszellen entwickelten, die Antikörper mit veränderter Epitopspezifität im Einklang mit der Epitopmaskierung exprimierten. Dies könnte auch die Verschiebung der Gedächtnis-B-Zellspezifität weg von Klasse 1 und 2 nach der dritten Dosis der SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffe erklären, die die Breite der neutralisierenden Reaktion erhöht9.

Beginnend mit Experimenten zu Anti-Diphtherie-Toxin-Antikörpern zu Beginn des 20. Jahrhunderts zeigten umfangreiche Arbeiten an Versuchstieren, dass der passive Transfer von polyklonalem Immunserum oder monoklonalen Antikörpern nachfolgende humorale Immunantworten auf epitopspezifische Weise verändern kann1,2. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Epitopmaskierung durch bereits vorhandene Antikörper die epitopspezifische Plasmablastenreaktion auf die Malariaimpfung beeinträchtigt28,29. In Malaria-Impfstoffversuchen erzeugte eine dritte Impfstoffdosis einen geringeren Anteil hochaffiner Antikörper produzierender Plasmablasten als die zweite, was auf die Maskierung von Epitopen zurückgeführt wurde. Die maskierende Wirkung bereits vorhandener hochaffiner Antikörper wurde bei transgenen Mäusen bestätigt und zeigte, dass hochaffine Antikörper den Eintritt von B-Zellen in Keimzentren auf epitopspezifische Weise blockieren29,30,31. Diese Ergebnisse wurden jedoch im Kontext eines eingeschränkten transgenen B-Zell-Repertoires erzielt und die Wirkung bereits vorhandener Antikörper auf die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen in polyklonalen Reaktionen wurde nicht untersucht29. Die Ergebnisse unserer klinischen Studien und Mausexperimente stimmen mit der Beobachtung überein, dass bereits vorhandene Antikörper die Entwicklung epitopspezifischer B-Zellen blockieren32,33. Unsere Experimente erweitern frühere Beobachtungen, da wir auch die Spezifität und Antigen-Bindungsaffinität der Antikörper untersucht haben, die von B-Zellen produziert werden, die in Gegenwart bereits vorhandener Antikörper auf Antigene reagieren. Insbesondere fanden wir heraus, dass bereits vorhandene hochaffine Antikörper die Affinitätsschwelle für die Beteiligung von B-Zellen an der Immunantwort senken. Infolgedessen weisen die Anti-SARS-CoV2-Antikörper, die von B-Gedächtniszellen exprimiert werden, die sich bei Menschen entwickeln, die vor der Impfung monoklonale Antikörperinfusionen erhalten haben, überwiegend eine niedrige Affinität auf. Im Gegensatz dazu können polyklonale Antikörper mit niedriger Affinität, die nach einer Impfvorbereitung entstehen, die Reaktionen auf Auffrischimpfungen durch Mechanismen verstärken, die noch nicht vollständig aufgeklärt sind2,3,31.

Gedächtnis-B-Zellen können sich auf zwei verschiedenen Wegen entwickeln18,19. In Keimzentren entwickeln sich klassenvertauschte Gedächtnis-B-Zellen, die Antikörper mit relativ höherer Affinität und einer hohen Anzahl somatischer Mutationen tragen. Im Gegensatz dazu entwickeln sich IgM-exprimierende Gedächtnis-B-Zellen, die Antikörper mit geringerer Affinität tragen und nur eine geringe Anzahl von Mutationen aufweisen, über einen vom Keimzentrum unabhängigen Weg18,20. Unsere menschlichen Daten legen nahe, dass die passive Übertragung von C144-LS und C135-LS den vom Keimzentrum unabhängigen Weg durch die Bildung von Immunkomplexen begünstigen könnte (Übersicht in Lit. 34). Immunkomplexe fangen und binden Antigene in lymphatischen Organen und erhöhen dadurch die lokale Antigenkonzentration. Darüber hinaus enthalten sie mehrere Kopien des Antigens in einer Form, die die scheinbare Affinität durch Aviditätseffekte erhöht und so die Rekrutierung von B-Zellen mit Rezeptoren mit sehr geringer Affinität in die Immunantwort ermöglicht34. Zusammengenommen reduzieren die erhöhte Antigenkonzentration und die Aviditätseffekte die Selektionsstringenz und helfen, den Anstieg der RBD-bindenden B-Zellen mit niedriger Affinität zu erklären, die in Empfängern menschlicher monoklonaler Antikörper gefunden werden, da dies die Aktivierung einer größeren Anzahl reichlich vorhandener RBD-bindender B-Zellen ermöglicht Klone, die sonst nicht für die Immunantwort rekrutiert würden. Somit diversifiziert die Kombination aus Epitopmaskierung und verringerten Affinitätsschwellen die daraus resultierenden B-Zell-Reaktionen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Zusammensetzung der Keimzentren und die Entwicklung des Gedächtnisses als Reaktion auf die Impfung durch bereits vorhandene Antikörper beeinflusst werden, die das Antikörperzielprofil, die Affinität und den Isotyp der reagierenden Zellen verändern können. Die Diversifizierung der Antikörperantwort durch diesen Mechanismus kann dazu beitragen, die Breite von Impfstoffen wie dem SARS-CoV-2-Impfstoff zu erhöhen, beeinträchtigt jedoch die Entwicklung der Breite und Wirksamkeit bei anderen Impfstoffen wie HIV-1 oder Influenza, indem sie die Immunität von der weitgehenden Neutralisierung ablenkt auf stammspezifische Epitope und indem es einer zunehmenden Anzahl von Vorläufern mit niedriger Affinität, die Off-Target-Antikörper exprimieren, ermöglicht wird, an der Immunantwort teilzunehmen.

Die Teilnehmer der Empfängergruppe mit monoklonalen Antikörpern waren gesunde SARS-CoV-2-naive Freiwillige, die an einer ersten Phase-1-Studie am Menschen am Rockefeller University Hospital in New York teilnahmen und Einzeldosen von zwei Anti-SARS-CoV-Antikörpern erhielten -2 monoklonale RBD-Antikörper, C144-LS und C135-LS, zwischen dem 13. Januar und dem 3. März 2021 (NCT04700163). Die klinische Phase-1-Studie hatte ein Dosis-Eskalations-Design und bewertete die Sicherheit und Verträglichkeit sowie die Pharmakokinetik der beiden monoklonalen Antikörper. Der monoklonale Antikörpercocktail (Verhältnis von C144-LS und C135-LS im Verhältnis 1:1) wurde 21 der 23 eingeschlossenen Personen verabreicht (n = 2 erhielten Placebo), was mehrere vorläufige Sicherheitsanalysen ermöglichte. Die monoklonalen Antikörper wurden jeweils 100 oder 200 mg sc oder 1, 5 oder 15 mg pro kg iv verabreicht (Ergänzungstabelle 2). Geeignete Teilnehmer für die Phase-1-Studie waren gesunde Erwachsene ohne Vorgeschichte einer SARS-CoV-2-Infektion oder -Impfung oder ohne vorherige Einnahme von SARS-CoV-2-Therapeutika, einschließlich anderer monoklonaler Antikörper oder Plasma von rekonvaleszenten Personen. Weitere Einzelheiten zu den Einschluss- und Ausschlusskriterien, dem Studiendesign und den Endpunkten der Phase-1-Studie finden Sie unter ClinicalTrials.gov (NCT04700163). Von den 21 Personen, die in der Phase-1-Studie die monoklonalen Antikörper erhielten, nahmen 18 an einer parallelen Beobachtungsstudie teil, um ihre Immunantworten auf eine nachfolgende SARS-CoV-2-mRNA-Impfung zu bewerten. Eine Person entschied sich für den Janssen-Impfstoff (Ad26.COV2.S), und eine andere Person (ein Placebo-Empfänger) zeigte vor der Aufnahme in die Beobachtungsstudie Veränderungen des N-Titers, die mit einer kürzlich erfolgten SARS-CoV-2-Infektion vereinbar waren, was sie nicht förderfähig machte für die Aufnahme in diese Studie. Die übrigen Teilnehmer der Phase-1-Studie entschieden sich, nicht an der parallelen Studie zu Immunantworten teilzunehmen. Die 18 Empfänger monoklonaler Antikörper, die in diese Beobachtungsstudie einbezogen wurden, erhielten entweder die mRNA-Impfstoffe Moderna (Spikevax, mRNA-1273) oder Pfizer-BioNTech (Comirnaty, BNT162b2) gegen den WT-Stamm (Wuhan-Hu-1) des schweren Coronavirus mit akutem respiratorischem Syndrom 2 (SARS-CoV-2). Die Teilnehmer der geimpften Kontrollgruppe waren gesunde SARS-CoV-2-naive Freiwillige, die zwei Dosen eines der beiden derzeit zugelassenen SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffe Moderna (Spikevax, mRNA-1273) oder Pfizer-BioNTech erhalten hatten ( Comirnaty, BNT162b2). Diese Kontrollpersonen wurden für serielle Blutspenden an das Rockefeller University Hospital rekrutiert, um ihre Immunantworten auf die SARS-CoV-2-mRNA-Impfung im Längsschnitt zu bewerten9,11. Wir haben zuvor über die Ergebnisse dieser Gruppe berichtet und verweisen auf Referenzen. 9,11 für weitere Einzelheiten zur Teilnehmerrekrutierung, Einschluss- und Ausschlusskriterien und demografischen Merkmalen (Ergänzungstabellen 1 und 2). Bei jedem Probeentnahmebesuch stellten sich die Teilnehmer beider Gruppen zur Blutentnahme im Rockefeller University Hospital vor und wurden gebeten, Einzelheiten zu ihrem Impfschema, möglichen Nebenwirkungen, Komorbiditäten und einer möglichen COVID-19-Vorgeschichte anzugeben. Impfungen wurden außerhalb der Studie verabreicht, nach Ermessen des Einzelnen und seines Gesundheitsdienstleisters im Einklang mit den bestehenden Richtlinien und wurden daher nicht durch ihre Teilnahme an unserer Studie beeinflusst. Basis- und Längsplasmaproben wurden auf Bindungsaktivität an das Nukleokapsidprotein (N; Sino Biological, 40588-V08B) von SARS-CoV-2 getestet. Das Fehlen einer Serokonversion in Richtung N während des Studienintervalls wurde zusätzlich zur gemeldeten Vorgeschichte der Teilnehmer zum Ausschluss einer SARS-CoV-2-Infektion herangezogen. Die Erfassung und Verwaltung klinischer Daten erfolgte mit der Software iRIS von iMedRIS (v.11.02). Alle Teilnehmer gaben vor der Teilnahme an der Studie, die im Einklang mit der guten klinischen Praxis durchgeführt wurde, eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Studie wurde unter Einhaltung aller relevanten ethischen Vorschriften durchgeführt und die klinischen Protokolle (CGA-1015 und DRO-1006) für Studien mit menschlichen Teilnehmern wurden vom Institutional Review Board der Rockefeller University genehmigt. Detaillierte Teilnehmermerkmale finden Sie in den Ergänzungstabellen 1 und 2 sowie in den Referenzen. 9,11.

Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut, die aus an der Rockefeller University gesammelten Proben gewonnen wurden, wurden wie zuvor berichtet durch Gradientenzentrifugation gereinigt und in flüssigem Stickstoff in Gegenwart von fötalem Kälberserum (FCS) und Dimethylsulfoxid gelagert5. Heparinisierte Plasma- und Serumproben wurden aliquotiert und bei –20 °C oder weniger gelagert. Vor den Experimenten wurden Aliquote der Plasmaproben hitzeinaktiviert (1 Stunde bei 56 °C) und dann bei 4 °C gelagert.

Um die pharmakokinetischen Eigenschaften der passiv verabreichten Antikörper C144-LS und C135-LS zu bewerten, wurden ihre Serumantikörperspiegel am Tag der Antikörperverabreichung (Tag 0), 1, 3, 6, 9 und 12 Stunden nach der Infusion usw. gemessen Tage 1, 3, 7, 14, 21, 28, 56, 84, 126, 168, 252 und 336. Die C144-LS- und C135-LS-Spiegel im Serum wurden mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) gemessen. Kurz gesagt, Analyten wurden aus Serumproben durch Immunocapture unter Verwendung von Streptavidin-Kügelchen und biotinyliertem RBD-Protein isoliert. Die isolierten Proteine ​​wurden mit Dithiothreitol denaturiert, mit Iodacetamid alkyliert und mit Trypsin verdaut. Der Endextrakt wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Säulenumschaltung und MS/MS-Detektion mittels Positivionen-Elektrospray analysiert. Zur Quantifizierung wurde ein linearer, 1/Konzentration2-gewichteter Regressionsalgorithmus nach der Methode der kleinsten Quadrate verwendet. Mithilfe einer nicht-kompartimentellen Analyse wurden die pharmakokinetischen Parameter anhand der gemessenen Serumspiegel von C144-LS und C135-LS geschätzt. Für die nicht-kompartimentelle Analyse wurde Phoenix WinNonlin (v.8.2) verwendet. Für die Schätzung der pharmakokinetischen Parameter im Serum wurde anstelle der nominalen Zeit die tatsächliche Probenzeit nach der Verabreichung jedes monoklonalen Antikörpers verwendet. Die Schätzungen der Halbwertszeit waren zwischen den Verabreichungswegen für C144-LS und C135-LS ähnlich, was auf eine Halbwertszeit von 2–3 Monaten für beide monoklonalen Antikörper bei beiden Verabreichungswegen hindeutet (C144-LS: 68,9 bis 99,3 Tage für sc-Gruppen und). 86,9 bis 92,3 Tage für iv-Gruppen; C135-LS: 72,7 bis 77,9 Tage für sc-Gruppen und 70,5 bis 94,7 Tage für iv-Gruppen). Die Visualisierung der pharmakokinetischen Daten erfolgte in GraphPad Prism unter Verwendung des Drei-Phasen-Zerfallsmodells.

C57BL/6J-Mäuse wurden von Jackson gekauft. Bei den verwendeten Mäusen handelte es sich ausschließlich um weibliche Mäuse im Alter von 6–12 Wochen zu Beginn der Experimente. Die Mäuse wurden bei einer Temperatur von 22 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 30–70 % in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit ad libitum-Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Fußballenimmunisierungen wurden unter Verwendung von 25 µl 1x PBS, enthaltend 5 µg rekombinantes RBD und 8,5 µl 2 % Alhydrogel (Invivogen, 21645-51-2), durchgeführt. 3BNC117/10-1074- und C135/C144-Antikörpercocktails wurden mit 100 μg jedes Antikörpers hergestellt und in 1× PBS durch iv-Injektion verabreicht. Alle Tierversuche und -versuche wurden ohne Verblindung oder Randomisierung und gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Rockefeller University genehmigten Protokollen durchgeführt.

ELISA-Assays36,37 zur Bewertung der Antikörperbindung an SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 RBD, NTD oder S wurden durch Beschichten hochbindender 96-Halbwellplatten (Corning 3690) mit 50 μl pro Well einer 1 μg-Lösung durchgeführt ml−1 Proteinlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) über Nacht bei 4 °C. Die Platten wurden sechsmal mit Waschpuffer (1× PBS mit 0,05 % Tween-20 (Sigma-Aldrich)) gewaschen und mit 170 μl pro Vertiefung Blockierungspuffer (1× PBS mit 2 % BSA und 0,05 % Tween-20 (Sigma)) inkubiert -Aldrich)) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Unmittelbar nach der Blockierung wurden monoklonale Antikörper oder Plasmaproben in PBS gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Plasmaproben wurden mit einer Ausgangsverdünnung von 1:66 getestet und seriell entweder um das Dreifache oder das Vierfache verdünnt. Monoklonale Antikörper wurden mit einer Ausgangskonzentration von 10 μg ml−1 und 11 weiteren dreifachen Verdünnungsreihen getestet. Die Platten wurden sechsmal mit Waschpuffer gewaschen und dann mit antihumanem IgG- oder IgM-Sekundärantikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase (HRP) (Jackson Immuno Research, 109-036-088 und 109-035-129), in Blockierungspuffer bei a inkubiert 1:5.000 Verdünnung (IgM und IgG). Die Platten wurden durch Zugabe des HRP-Substrats 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (Thermo Fisher Scientific) für 6 Minuten entwickelt. Die sich entwickelnde Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 1 M H2SO4 gestoppt und die Absorption wurde bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Mikroplattenlesegeräts (FluoStar Omega, BMG Labtech) mit Omega- und Omega MARS-Software zur Analyse gemessen. Auf jeder Platte waren Normalisierungskontrollproben enthalten. Für Plasmaproben und monoklonale Antikörper wurden halbmaximale Bindungstiter (BT50) bzw. halbmaximale effektive Konzentrationen (EC50) mithilfe eines nichtlinearen Regressionsmodells mit vier Parametern (GraphPad Prism v.9.3) mit den folgenden Einstellungen berechnet: [ Agonist] vs. Reaktion – variable Steigung (vier Parameter); unten = 0; Hangneigung > 0; oben = experimentelles oberes Plateau des Normalisierer-Kontrollantikörpers oder der Plasmaprobe, das für mindestens 3 aufeinanderfolgende Verdünnungsschritte die Sättigung erreicht. Die Kurvenanpassung wurde auf eine Obergrenze beschränkt, die der maximalen optischen Dichte entspricht, die durch die bekannte Normalisierungssteuerung erreicht wird, um die Variabilität zwischen Platten und Experimenten (Batch-Effekte) zu begrenzen. Pentamere IgM-BT50-Werte wurden unter Verwendung zuvor gemessener IgG-Antikörper als Normalisierungskontrollen ermittelt. Präpandemische Plasmaproben von gesunden Spendern und monoklonale Isotyp-Kontrollantikörper wurden wie angegeben als Negativkontrollen verwendet und zur Validierung verwendet5. Alle angegebenen EC50- und BT50-Werte sind der Durchschnitt von mindestens zwei unabhängigen Experimenten.

Der Säugetier-Expressionsvektor, der für die RBD von SARS-CoV-2 kodiert (GenBank MN985325.1; S-Protein-Reste 319–539), wurde bereits beschrieben26. Plasmide, die die R346S/E484K- und N440K/E484K-Substitutionen kodieren, wurden unter Verwendung eines ortsspezifischen Mutagenese-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (New England Biolabs (NEB), E0554S) erzeugt. Alle Konstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt und zur Expression löslicher Proteine ​​durch vorübergehende Transfektion von Expi293F-Zellen (Gibco/Thermo Fisher Scientific, A14527) verwendet. Die Überstände wurden nach 4 Tagen gesammelt und die RBD-Proteine ​​wurden durch Nickel-Affinitätschromatographie gereinigt. S 6P-Proteine ​​wurden durch Nickelaffinität und anschließende Größenausschlusschromatographie gereinigt. Die Peakfraktionen aus der Größenausschlusschromatographie wurden mittels nativer Gelelektrophorese identifiziert, und die Peakfraktionen, die monomeren RBDs oder S-Trimeren entsprachen, wurden gepoolt und bei 4 °C gelagert.

Ein Plasmid, das SARS-CoV-2 S im Kontext von pSARS-CoV-2-SΔ19 (Wuhan-Hu-1) exprimiert, wurde bereits beschrieben6, und ein Derivat von pSARS-CoV-2-SΔ19 mit einer gestörten Furin-Spaltungsstelle wurde durch die Einführung der R683G-Substitution6 erzeugt. Eine Störung der Furin-Spaltungsstelle führt zu einer erhöhten Partikelinfektiosität. Ein Plasmid, das SARS-CoV-2 Omicron BA.4/5 S exprimiert und die R683G-Substitution trägt, wurde bereits zuvor beschrieben38. Zwei Plasmide, die C135/C144-Antikörper-Escape-Mutationen enthielten, wurden auf der Basis von pSARS-CoV-2-SΔ19 R683G durch Overlap-Extension-PCR-vermittelte Mutagenese und Gibson-Assemblierung konstruiert. Im Einzelnen wurden folgende Substitutionen eingeführt: R346S/Q493K und R346S/N440K/E484K. Da diese Substitutionen in den pSARS-CoV-2-SΔ19 R683G-Hintergrund eingebaut wurden, wurde die neutralisierende Aktivität gegen alle mutierten und Varianten-Pseudoviren mit einer WT SARS-CoV-2 S-Sequenz (GenBank: NC_045512) verglichen, die ebenfalls R683G trägt (pSARS- CoV-2-SΔ19 R683G) gegebenenfalls wie angegeben. Pseudotypisierte SARS-CoV-2-Partikel wurden wie zuvor beschrieben erzeugt5,14. Kurz gesagt, HEK293T-Zellen wurden mit pNL4-3ΔEnv-nanoluc und pSARS-CoV-2-SΔ19 transfiziert und die Partikel wurden 48 Stunden nach der Transfektion gesammelt, gefiltert und bei –80 °C gelagert.

Fünffach seriell verdünntes präpandemisches Negativkontrollplasma von gesunden Spendern (technische Negativkontrollen, Daten nicht gezeigt), Plasma von geimpften monoklonalen Antikörperempfängern und mRNA-geimpften Kontrollen oder monoklonale Antikörper wurden 1 Stunde lang mit dem pseudotypisierten SARS-CoV-2-Virus inkubiert 37 °C. Die Mischung wurde anschließend 48 Stunden lang mit HEK293T-ACE2-Zellen5 (für alle monoklonalen Antikörper-WT-Neutralisationstests) oder HT1080Ace2 cl14-Zellen6 (für alle Plasmaneutralisationstests) 48 Stunden lang inkubiert, wonach die Zellen mit PBS gewaschen und mit Luciferase Cell Culture Lysis 5× lysiert wurden Reagenz (Promega). Die Nanoluc-Luciferase-Aktivität in den Lysaten wurde mit dem Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega) mit dem ClarioStar Multimode-Lesegerät (BMG, v.5.70.R3) gemessen. Die relativen Lumineszenzeinheiten wurden auf diejenigen normalisiert, die von Zellen stammen, die mit dem pseudotypisierten SARS-CoV-2-Virus in Abwesenheit von Plasma oder monoklonalen Antikörpern infiziert waren. Der halbmaximale Neutralisationstiter für Plasma (NT50) oder halbmaximale und 90 %ige Hemmkonzentrationen für monoklonale Antikörper (IC50 und IC90) wurden mithilfe einer nichtlinearen Vier-Parameter-Regression (Regressionsmethode der kleinsten Quadrate ohne Gewichtung; Einschränkungen: oben = 1) bestimmt , unten=0; in GraphPad Prism).

Gereinigte und Avi-markierte SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 RBD oder S wurden mit dem Biotin-Protein Ligase-BIRA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Avidity) wie zuvor beschrieben5 biotinyliert. Ovalbumin (Sigma-Aldrich, A5503-1G) wurde mit dem EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Thermo Fisher Scientific) biotinyliert. Biotinyliertes Ovalbumin wurde zur Bestimmung menschlicher Einzelzellen mit Streptavidin-BV711 (BD Biosciences, 563262) oder zur Phänotypisierung mit Streptavidin-BB515 (BD Biosciences, 564453) konjugiert. Für alle Experimente an Menschen und Mäusen wurde RBD an Streptavidin-PE (BD Biosciences, 554061) und Streptavidin-AF647 (BioLegend, 405237)5,9 konjugiert.

Die Einzelzellsortierung mittels Durchflusszytometrie wurde bereits beschrieben5. Kurz gesagt, wurden mononukleäre Zellen des peripheren Bluts durch negative Selektion unter Verwendung eines Pan-B-Zell-Isolierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Miltenyi Biotec, 130-101-638) auf B-Zellen angereichert. Vor der Färbung wurden die angereicherten B-Zellen mit einem FcR-blockierenden Antikörper (BD, 564220) in einer 1:200-Verdünnung in fluoreszenzaktiviertem Zellsortierungspuffer (FACS) (1 × PBS, 2 % FCS, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure) inkubiert ( EDTA)) für 20 Min. auf Eis. Anschließend wurden die Zellen in FACS-Puffer mit den folgenden Anti-Human-Antikörpern (alle in einer Verdünnung von 1:200) inkubiert: Anti-CD20-PECy7 (BD Biosciences, 335793), Anti-CD3-APC-eFluro 780 (Invitrogen, 47-0037). -41), Anti-CD8-APC-eFluor 780 (Invitrogen, 47-0086-42), Anti-CD16-APC-eFluor 780 (Invitrogen, 47-0168-41), Anti-CD14-APC-eFluor 780 (Invitrogen , 47-0149-42) und Zombie NIR (BioLegend, 423105) sowie Fluorophor-markiertes RBD und Ovalbumin (Ova) für 30 Minuten auf Eis. AccuCheck Counting Beads (Life Technologies, PCB100) wurden wie angegeben zu jeder Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt. Einzelne CD3-CD8-CD14-CD16-CD20+Ova-RBD-PE+RBD-AF647+ B-Zellen wurden in einzelne Vertiefungen von Platten mit 96 Vertiefungen sortiert, die 4 μl Lysepuffer (0,5 × PBS, 10 mM Dithiothreitol, 3.000 U ml) enthielten −1 RNasin-Ribonuklease-Inhibitoren (Promega, N2615) pro Vertiefung unter Verwendung des FACS Aria III-Systems und der FACSDiva-Software (Becton Dickinson) zur Erfassung und FlowJo zur Analyse. Die sortierten Zellen wurden auf Trockeneis eingefroren und dann bei –80 °C gelagert anschließende RNA-Reverse-Transkription. Für die Analyse des B-Zell-Phänotyps wurden B-Zellen zusätzlich zu den oben genannten Antikörpern auch mit den folgenden Anti-Human-Antikörpern (alle in einer Verdünnung von 1:200) gefärbt: Anti-CD19-BV605 (BioLegend, 302244), Anti- IgG-PECF594 (BD, 562538), Anti-IgM-AF700 (BioLegend, 314538) und Anti-CD38-BV421 (BioLegend, 303526).

Popliteale Lymphknoten von Mäusen wurden in FACS-Puffer (1 × PBS, 2 % FBS, 2 mM EDTA) gesammelt, mechanisch aufgeschlossen und durch ein 35 μM-Sieb (Corning, 352235) filtriert. Anschließend wurden die Zellen jeweils 20 Minuten lang iterativen Färbezyklen auf Eis unterzogen (alle Antikörper wurden auf 1:200 verdünnt, sofern nicht anders angegeben): (1) Anti-Maus-CD16/32 (Mouse BD FC Block, BD Biosciences, 553142); (2) Fluorophor-konjugiertes RBD (siehe oben); (3) Anti-T- und Anti-B-Zellaktivierungsantigen-FITC (BD Biosciences, 553666), Anti-CD38-PB (BioLegend, 102720; 1:100-Verdünnung), Anti-CD45R/B220-BV605 (BioLegend, 103244) , Anti-CD4-APC-eFluor780 (Invitrogen, 47-0042-82), Anti-CD8a-APC-eFluor780 (Invitrogen, 47-0081-82), Anti-NK1.1-APC-eFluor780 (Invitrogen, 47-5941 -82), Anti-F4/80-APC-eFluor780 (Invitrogen, 47-4801-82), Anti-CD95-PE-Cy7 (BD Biosciences, 557653) und Zombie NIR (BioLegend, 423105, 1:1.000). AccuCheck Counting Beads (Life Technologies, PCB100) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers zu den Proben gegeben. Einzelne CD4-CD8a-NK1.1-F4/80-B220+CD38-GL7+CD95+-Zellen wurden auf dem BD FACSymphony S6-System in 96-Well-Platten sortiert, die 1 % 2-β-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) in TCL-Puffer enthielten (Qiagen, 1031576) und anschließend auf Trockeneis eingefroren und zur RNA-Reverse-Transkription bei –80 °C gelagert.

Menschliche Antikörper wurden wie zuvor beschrieben5,39 identifiziert und sequenziert. Kurz gesagt, RNA aus einzelnen Zellen wurde revers transkribiert (SuperScript III Reverse Transcriptase, Invitrogen, 18080-044) und die cDNA wurde bei –20 °C gelagert oder für die anschließende Amplifikation der variablen IGH-, IGL- und IGK-Gene durch verschachtelte PCR verwendet und Sanger-Sequenzierung. Die Sequenzanalyse wurde mit MacVector (v.17.5.4) und Geneious Prime (v.2020.1.2 und v.2022.1.1) durchgeführt. Amplikons aus der ersten PCR-Reaktion wurden als Matrizen für die sequenz- und ligationsunabhängige Klonierung in Antikörper-Expressionsvektoren verwendet. Monoklonale Maus-Antikörper wurden sequenziert und aus einzelnen FACS-sortierten B-Zellen wie zuvor beschrieben40,41 mit den folgenden Modifikationen kloniert. Kurz gesagt, RNA aus einzelnen Zellen in 96-Well-Platten wurde mithilfe von Magnetkügelchen (RNAClean XP, Beckman Coulter, A63987) gereinigt. Einzelzell-RNA wurde aus Magnetkügelchen mit 11 μl einer Lösung eluiert, die 14,4 ng μl–1 Zufallsprimer (Invitrogen, 48190011) und 0,5 % IGEPAL CA-630 (10 % in destilliertem H–O, Sigma-Aldrich, I8896) enthielt -50 ml) und 0,6 U μl−1 RNase-Inhibitor (Promega, N2615) in nukleasefreiem Wasser (Qiagen, 129115), gefolgt von einer 3-minütigen Inkubation bei 65 °C. cDNA wurde durch reverse Transkription (SuperScript III Reverse Transcriptase 10.000 U, Invitrogen, 18080-044) synthetisiert und nach Zugabe von 10 μl nukleasefreiem Wasser bei –20 °C gelagert. Die anschließende Amplifikation der variablen IGH- und IGK-Antikörpergene wurde durch verschachtelte PCR unter Verwendung von HotstarTaq-DNA-Polymerase (Qiagen, 203209) unter Verwendung zuvor veröffentlichter Primer41 und der folgenden Thermocycler-Bedingungen für Annealing (siehe Details unten) und Elongation (alle 72 °C/55 s) erreicht ) und Anzahl der Zyklen: PCR1 (IGG, IGM und IGK): 46 °C/30 s/50 Zyklen; PCR2 (IGG und IGM): 55 °C/30 s/50 Zyklen; PCR2 (IGK): 46 °C/30 s/50 Zyklen. Nach der Reinigung wurden die PCR-Produkte der schweren und leichten Kette einer Sanger-Sequenzierung unterzogen und anschließend mit MacVector und Geneious Prime (v.2022.1.1) sowie der unten beschriebenen Bioinformatik-Pipeline analysiert. Maus-Ig-Sequenzen wurden als eBlocks (IDT) mit kurzen Homologien für sequenz- und ligationsunabhängiges Klonen bestellt und wie zuvor beschrieben in menschliche IGHG1-Fab- und IGLK-Expressionsvektoren kloniert41. Alle Plasmidsequenzen wurden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert, und alle rekombinanten monoklonalen Antikörper (aus menschlichen Gedächtnis-B-Zellen stammendes IgG in voller Länge und His6-markierte, aus Mäusen stammende menschliche IgG1-Fab-Fragmente) wurden anschließend wie zuvor beschrieben hergestellt und gereinigt5,41. Um pentamere IgMs herzustellen, wurde die Klonierung aus PCR-Produkten durch Sequenzierung und ligationsunabhängiges Klonen wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das variable IGH-Gen in einen Igμ-Expressionsvektor (InvivoGen, pfusess-hchm3) kloniert wurde. Pentamere IgMs wurden dann durch vorübergehende Transfektion von HEK293-6E-Zellen mit Vektoren exprimiert, die die entsprechende J-Kette, leichte Kette und schwere Kette in einem Verhältnis von 1:1,5:1,5 codieren. Sekretierte IgMs wurden nach 6 Tagen aus Zellüberständen gesammelt und mit dem POROS CaptureSelect IgM Affinity Matrix Kit (Thermo Fisher Scientific, 1952890500) gereinigt. Affinitätsgereinigte IgMs wurden durch Größenausschlusschromatographie weiter gereinigt. Spitzenfraktionen pentamerer IgMs wurden mittels SDS-PAGE analysiert, gepoolt und unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit Amicon Ultra 100 kDa (Millipore) in PBS gepuffert.

BLI-Assays wurden wie zuvor beschrieben5,15,41 mit geringfügigen Modifikationen wie unten durchgeführt. Kurz gesagt, wir verwendeten das ForteBio Octet Red-Instrument (ForteBio Data Acquisition-Software Version 11.1.3.25) bei 30 °C unter Schütteln bei 1.000 U/min. Monomere Affinitäten von Anti-SARS-CoV-2-RBD-IgG und Fab-Fragmenten zu RBD wurden durch abgeleitet Subtrahieren des Signals, das von Spuren erhalten wurde, die mit demselben IgG/Fab in Abwesenheit von WT-RBD durchgeführt wurden. Die kinetische Analyse unter Verwendung eines Protein-A-Biosensors (ForteBio, 18-5010) für menschliche IgGs wurde wie folgt durchgeführt: (1) Grundlinie: Eintauchen für 60 s in Puffer (1× Octet Kinetic Buffer, Sartorius, 18-1105); (2) Beladung: Eintauchen für 200 s in eine Lösung mit IgGs bei 10 μg ml−1; (3) Grundlinie: 200 s langes Eintauchen in Puffer; (4) Assoziation: Eintauchen für 300 s in Lösung mit WT-RBD in drei verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 200 bis 5 μg ml−1; (5) Dissoziation: 600 s langes Eintauchen in Puffer. Die Kurvenanpassung wurde mit einem schnellen 1:1-Bindungsmodell und der Datenanalysesoftware von ForteBio durchgeführt. Die mittleren Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (Kd) wurden durch Mittelung aller Bindungskurven bestimmt, die der theoretischen Anpassung mit einem R2-Wert von ≥ 0,8 entsprachen. Um die Bindung von Antikörpern mit niedriger Affinität an multimerisiertes Antigen herzustellen, wurden 6P-stabilisierte und biotinylierte S-Trimere mit rekombinantem Streptavidin (ACROBiosystems, STN-N5116) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, was zu bis zu 12 RBD-bindenden Einheiten pro Molekül führte getestet auf dem Octet Red-Instrument (ForteBio) wie oben beschrieben, mit der folgenden Modifikation: Assoziationsschritt (4) wurde mit dem S-Multimer bei 430 μg ml-1 durchgeführt. Epitop-Mapping-Assays wurden mit einem Protein-A-Biosensor (ForteBio, 18-5010) gemäß dem Protokoll des Herstellers „klassischer Sandwich-Assay“ wie folgt durchgeführt: (1) Sensorprüfung: Sensoren wurden 30 s lang nur in Puffer eingetaucht (Puffer ForteBio, 18). -1105); (2) ersten Antikörper einfangen: Sensoren wurden 10 Minuten lang mit Antikörper 1 bei 10 μg ml–1 eingetaucht; (3) Basislinie: Sensoren wurden 30 Sekunden lang nur in Puffer eingetaucht; (4) Blockierung: Sensoren wurden 5 Minuten lang mit IgG-Isotypkontrolle (3BNC117) bei 20 μg ml-1 eingetaucht; (5) Grundlinie: Sensoren wurden 30 s lang nur in Puffer eingetaucht; (6) Antigen-Assoziation: Sensoren wurden 5 Minuten lang mit RBD bei 20 μg ml–1 eingetaucht; (7) Basislinie: Sensoren wurden 30 s lang nur in Puffer eingetaucht. (8) Assoziationsantikörper b2: Die Sensoren wurden 5 Minuten lang mit Antikörper 2 bei 10 μg ml–1 eingetaucht. Der Affinitätstest von humanen IgG1-Fab-Fragmenten aus dem Keimzentrum von Mäusen, die aus B-Zellen stammen, wurde mit den gleichen Schritten und den Einstellungen des Octet Red-Instruments (ForteBio) wie für die aus dem humanen Gedächtnis stammenden IgG-Antikörper voller Länge (siehe oben) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: monoklonale Fab-Fragmente mit 50 μg ml–1 wurden für Schritt 2 auf FAB2G-Biosensoren (Sartorius 18-5125) eingefangen; In Schritt 4 wurde monovalentes RBD in Konzentrationen von 30 bis 120 μg ml-1 hinzugefügt. Bindungs-Fab-Fragmente mit messbaren Affinitäten wurden als biologisch plausible Assoziations- und Dissoziationskinetiken definiert (d. h. die Fähigkeit, sich in Schritt mit der Sättigung des Biosensors zu assoziieren). 2 und zeigt eine erkennbare Assoziation und Dissoziation des Antigens nach den Schritten (4) und (5) sowie einen berechneten Kd-Wert, der der theoretischen Anpassung mit einem R2-Wert von ≥0,75 entsprach. Affinitäten von Fab-Fragmenten, die bei der getesteten Konzentration nicht bis zur Sättigung auf dem Biosensor eingefangen wurden, konnten nicht aufgelöst werden und wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen (in der Ergänzungstabelle 6 als N/D markiert). In allen Fällen wurde die Kurvenanpassung mit der Analysesoftware ForteBio Octet Data (ForteBio Data Analysis HT v.11.1.3.50) durchgeführt.

Antikörpersequenzen wurden basierend auf der Qualität gekürzt und mit Igblastn v.1.14 mit dem IMGT-Domänenabgrenzungssystem annotiert. Die Annotation wurde systematisch mit dem Change-O-Toolkit (v.0.4.540)42 durchgeführt. Die Klonalität der schweren und leichten Kette wurde mithilfe von DefineClones.py bestimmt, das von Change-O (v.0.4.5)42 implementiert wurde. Das Skript berechnet die Hamming-Distanz zwischen jeder Sequenz im Datensatz und ihrem nächsten Nachbarn. Anschließend werden die Abstände normalisiert, um Unterschiede in der Länge der Verbindungssequenzen zu berücksichtigen, und die Klonalität wird auf der Grundlage eines Cut-off-Schwellenwerts von 0,15 bestimmt. Anschließend wurden schwere und leichte Ketten, die von derselben Zelle stammten, gepaart und Klonotypen auf der Grundlage ihrer V- und J-Gene unter Verwendung benutzerdefinierter R- und Perl-Skripte zugewiesen. Alle Skripte und Daten, die zur Verarbeitung von Antikörpersequenzen verwendet werden, sind öffentlich auf GitHub verfügbar (https://github.com/stratust/igpipeline/tree/igpipeline2_timepoint_v2). Die Häufigkeitsverteilung menschlicher V-Gene in Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern aus dieser Studie (Extended Data Abb. 4f–h) wurde mit 131.284.220 IgH- und IgL-Sequenzen verglichen, die in Lit. generiert wurden. 43 und heruntergeladen von cAb-Rep44 – einer online verfügbaren Datenbank menschlicher gemeinsamer BCR-Klonotypen (https://cab-rep.c2b2.columbia.edu/). Auf der Grundlage der 108 unterschiedlichen V-Gene, aus denen sich die 417 analysierten Sequenzen aus dem Ig-Repertoire der in dieser Studie beschriebenen Personen zusammensetzen (353 isolierte Sequenzen aus 5 monoklonalen Antikörperempfängern und 65 IgM-Sequenzen, isoliert aus 9 geimpften Kontrollpersonen (für IgG-Sequenzen). isoliert aus Kontrollen, siehe Lit. 9,11), haben wir die IgH- und IgL-Sequenzen aus der Datenbank ausgewählt, die teilweise von denselben V-Genen kodiert werden, und sie entsprechend der konstanten Region gezählt. Die in den erweiterten Daten gezeigten Häufigkeiten Abb. 4f– h beziehen sich auf die analysierte Quelle und den analysierten Isotyp. Wir verwendeten zweiseitige Binomialtests, um zu überprüfen, ob die Anzahl der Sequenzen, die zu einem bestimmten IGHV- oder IGLV-Gen im Repertoire gehören, entsprechend der Häufigkeit desselben IGV-Gens in der Datenbank unterschiedlich war. Die angepassten P-Werte wurden unter Verwendung einer Korrektur für die Rate falscher Entdeckungen berechnet. Signifikante Unterschiede sind mit Sternchen gekennzeichnet. Nukleotidsomatische Mutationen und die Länge der komplementaritätsbestimmenden Region (CDR3) wurden mithilfe benutzerdefinierter R- und Perl-Skripte bestimmt. Zur Quantifizierung somatischer Mutationen wurden die IGHV- und IGLV-Nukleotidsequenzen mithilfe von Igblastn mit ihren nächstgelegenen Keimbahnen abgeglichen und die Anzahl der Unterschiede als Anzahl der Nukleotidmutationen betrachtet.

Die Figuren wurden in Adobe Illustrator 2022 angeordnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten finden Sie in den Ergänzungstabellen 1–6. Die rohen Sequenzierungsdaten und Computerskripte im Zusammenhang mit den Abb. 2 und 4 und erweiterte Datenabbildungen. 3 und 7 wurden bei GitHub (https://github.com/stratust/igpipeline/tree/igpipeline2_timepoint_v2) hinterlegt. Diese Studie verwendet auch Daten aus „Eine öffentliche Datenbank mit Gedächtnis- und naiven B-Zell-Rezeptorsequenzen“ (https://doi.org/10.5061/dryad.35ks2), der Proteindatenbank (6VYB und 6NB6), cAb-Rep ( https://cab-rep.c2b2.columbia.edu/), dem Sequence Read Archive (SRP010970) und aus „High Frequency of Shared Clonotypes in Human B Cell Receptor Repertoires“ (https://doi.org/10.1038/s41586 -019-0934-8).

Computercode zur Verarbeitung der Antikörpersequenzen ist auf GitHub verfügbar (https://github.com/stratust/igpipeline/tree/igpipeline2_timepoint_v2).

Smith, T. Aktive Immunität, erzeugt durch sogenannte ausgewogene oder neutrale Mischungen aus Diphtherietoxin und Antitoxin. J. Exp. Med. 11, 241–256 (1909).

Artikel CAS Google Scholar

Heyman, B. Regulierung von Antikörperantworten über Antikörper, Komplement und Fc-Rezeptoren. Annu. Rev. Immunol. 18, 709–737 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Bournazos, S. & Ravetch, JV Fcgamma-Rezeptorfunktion und die Gestaltung von Impfstrategien. Immunität 47, 224–233 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Brouwer, PJM et al. Starke neutralisierende Antikörper von COVID-19-Patienten definieren mehrere Angriffspunkte. Wissenschaft 369, 643–650 (2020).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Robbiani, DF et al. Konvergente Antikörperreaktionen auf SARS-CoV-2 bei rekonvaleszenten Personen. Natur 584, 437–442 (2020).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Wang, Z. et al. Der mRNA-Impfstoff löste Antikörper gegen SARS-CoV-2 und zirkulierende Varianten aus. Natur 592, 616–622 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Yuan, M. et al. Strukturelle und funktionelle Auswirkungen der Antigendrift bei neueren SARS-CoV-2-Varianten. Wissenschaft 373, eabh1139 (2021).

Artikel Google Scholar

Barnes, CO et al. SARS-CoV-2-neutralisierende Antikörperstrukturen beeinflussen therapeutische Strategien. Natur 588, 682–687 (2020).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Mücksch, F. et al. Erhöhte Potenz und Breite der Gedächtnis-B-Zellen nach einem SARS-CoV-2-mRNA-Boost. Natur 607, 128–134 (2022).

Zalevsky, J. et al. Eine längere Halbwertszeit der Antikörper verbessert die In-vivo-Aktivität. Nat. Biotechnologie. 28, 157–159 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Cho, A. et al. Entwicklung von Anti-SARS-CoV-2-Rezeptor-Bindungsdomänen-Antikörpern nach mRNA-Impfung. Natur 600, 517–522 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Wang, Z. et al. Natürlich erhöhte Neutralisierungsbreite gegen SARS-CoV-2 ein Jahr nach der Infektion. Natur 595, 426–431 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Benschop, RJ et al. Der monoklonale Anti-SARS-CoV-2-Antikörper Bamlanivimab beeinflusst die endogene Immunantwort auf die COVID-19-Impfung nur minimal. Wissenschaft. Übers. Med. 14, eabn3041 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Schmidt, F. et al. Messung der SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörperaktivität mithilfe pseudotypisierter und chimärer Viren. J. Exp. Med. 217, e20201181 (2020).

Artikel Google Scholar

Viant, C. et al. Die Antikörperaffinität beeinflusst die Wahl zwischen dem Gedächtnis und dem Schicksal der Keimzentrums-B-Zellen. Zelle 183, 1298–1311 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Ise, W. et al. Die Stärke der T-Follikel-Helferzelle-Keimzentrum-B-Zell-Interaktion reguliert den Eintritt in die Plasmazelle oder das Schicksal der Keimzentrumzelle. Immunität 48, 702–715 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Phan, TG et al. Keimzentrums-B-Zellen mit hoher Affinität werden aktiv in das Plasmazellkompartiment selektiert. J. Exp. Med. 203, 2419–2424 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Kurosaki, T., Kometani, K. & Ise, W. Gedächtnis-B-Zellen. Nat. Rev. Immunol. 15, 149–159 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Victora, GD & Nussenzweig, MC Keimzentren. Annu. Rev. Immunol. 40, 413–442 (2022).

Artikel Google Scholar

Weisel, F. & Shlomchik, M. Gedächtnis-B-Zellen von Mäusen und Menschen. Annu. Rev. Immunol. 35, 255–284 (2015).

Artikel Google Scholar

Klein, U., Rajewsky, K. & Küppers, R. Humanes Immunglobulin (Ig)M+IgD+ periphere Blut-B-Zellen, die das Zelloberflächenantigen CD27 exprimieren, tragen somatisch mutierte Gene der variablen Region: CD27 als allgemeiner Marker für somatisch mutierte (Gedächtnis) B-Zellen. J. Exp. Med. 188, 1679–1689 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Klein, U., Küppers, R. & Rajewsky, K. Hinweise auf ein großes Kompartiment IgM-exprimierender Gedächtnis-B-Zellen beim Menschen. Blut 89, 1288–1298 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Taylor, JJ, Pape, KA & Jenkins, MK Ein vom Keimzentrum unabhängiger Signalweg erzeugt früh in der primären Reaktion nicht geschaltete Gedächtnis-B-Zellen. J. Exp. Med. 209, 597–606 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Viant, C. et al. Keimzentrumsabhängige und -unabhängige Gedächtnis-B-Zellen werden während der gesamten Immunantwort produziert. J. Exp. Med. 218, e20202489 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Weisel, FJ, Zuccarino-Catania, GV, Chikina, M. & Shlomchik, MJ Ein zeitlicher Schalter im Keimzentrum bestimmt die unterschiedliche Produktion von Gedächtnis-B- und Plasmazellen. Immunität 44, 116–130 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Barnes, CO et al. Strukturen menschlicher Antikörper, die an SARS-CoV-2-Spikes gebunden sind, zeigen gemeinsame Epitope und wiederkehrende Merkmale von Antikörpern. Zelle 182, 828–842 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Jette, CA et al. Breite Kreuzreaktivität zwischen Sarbecoviren, die von einer Untergruppe neutralisierender Antikörper aus COVID-19-Spendern gezeigt wird. Cell Rep. 36, 109760 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Kurtovic, L., Boyle, MJ & Beeson, JG Epitopmaskierung kann die Antikörperverstärkung bei Malariaimpfstoffen einschränken. Immunol. Zellbiol. 99, 126–129 (2021).

Artikel Google Scholar

McNamara, HA et al. Die Antikörperrückkopplung begrenzt die Ausweitung der B-Zell-Reaktionen auf die Malariaimpfung, fördert aber die Diversifizierung der humoralen Reaktion. Cell Host Microbe 28, 572–585 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Pape, KA, Taylor, JJ, Maul, RW, Gearhart, PJ & Jenkins, MK Verschiedene B-Zellpopulationen vermitteln das frühe und späte Gedächtnis während einer endogenen Immunantwort. Wissenschaft 331, 1203–1207 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Tas, JMJ et al. Antikörper aus primären humoralen Reaktionen modulieren die Rekrutierung naiver B-Zellen während sekundärer Reaktionen. Immunität 55, 1856–1871 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Meyer-Hermann, M. Die Injektion von Antikörpern gegen immundominante Epitope stimmt die Keimzentren so ab, dass weitgehend neutralisierende Antikörper erzeugt werden. Cell Rep. 29, 1066–1073 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Zarnitsyna, VI, Lavine, J., Ellebedy, A., Ahmed, R. & Antia, R. Multi-Epitop-Modelle erklären, wie bereits vorhandene Antikörper die Entstehung allgemein schützender Reaktionen auf Influenza beeinflussen. PLoS Pathog. 12, e1005692 (2016).

Artikel Google Scholar

Heesters, BA, Myers, RC & Carroll, MC Follikuläre dendritische Zellen: dynamische Antigenbibliotheken. Nat. Rev. Immunol. 14, 495–504 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Meffre, E. et al. Ersatzleichtketten, die menschliche periphere B-Zellen exprimieren, produzieren selbstreaktive Antikörper. J. Exp. Med. 199, 145–150 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Amanat, F. et al. Ein serologischer Test zum Nachweis der SARS-CoV-2-Serokonversion beim Menschen. Nat. Med. 26, 1033–1036 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Grifoni, A. et al. Ziele von T-Zell-Reaktionen auf das SARS-CoV-2-Coronavirus bei Menschen mit COVID-19-Erkrankung und nicht exponierten Personen. Zelle 181, 1489–1501 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, Z. et al. Reaktionen von Gedächtnis-B-Zellen auf Omicron-Subvarianten nach einer SARS-CoV-2-mRNA-Durchbruchinfektion beim Menschen. J. Exp. Med. 219, e20221006 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, Z. et al. Verbesserte SARS-CoV-2-Neutralisierung durch dimeres IgA. Wissenschaft. Übers. Med. 13, eabf1555 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Escolano, A. et al. Durch die Immunisierung werden B-Zellen, die für HIV-1-V3-Glykan spezifisch sind, bei Mäusen und Makaken vergrößert. Natur 570, 468–473 (2019).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Viant, C., Escolano, A., Chen, ST & Nussenzweig, MC Sequenzierung, Klonierung und Antigenbindungsanalyse von monoklonalen Antikörpern, die aus einzelnen Maus-B-Zellen isoliert wurden. STAR-Protokoll. 2, 100389 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Gupta, NT et al. Change-O: ein Toolkit zur Analyse umfangreicher B-Zell-Immunglobulin-Repertoire-Sequenzierungsdaten. Bioinformatik 31, 3356–3358 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Soto, C. et al. Hohe Häufigkeit gemeinsamer Klonotypen im Repertoire menschlicher B-Zell-Rezeptoren. Natur 566, 398–402 (2019).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Guo, Y., Chen, K., Kwong, PD, Shapiro, L. & Sheng, Z. cAb-Rep: eine Datenbank kuratierter Antikörperrepertoires zur Erforschung der Antikörpervielfalt und Vorhersage der Antikörperprävalenz. Vorderseite. Immunol. 10, 2365 (2019).

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Wir danken allen Studienteilnehmern, die ihre Zeit unserer Forschung gewidmet haben; das Pflegepersonal des Rockefeller University Hospital und das Clinical Research Support Office sowie das Pflegepersonal; alle Mitglieder des MCN-Labors für Diskussionen; M. Jankovic und G. Scrivanti für Laborunterstützung; T. Eisenreich für Hilfe bei der Verwaltung von Mäusekolonien und technische Hilfe; und K. Gordon für die Zellsortierung. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse P01-AI138398-S1 und 2U19-AI111825 an MCN unterstützt; R37-AI64003 an PDB und R01-AI78788 an TH; und 3UM1AI126620-5S1 an M. Caskey. DS-B. wird teilweise vom National Center for Advancing Translational Sciences (NIH Clinical and Translational Science Award-Programm, Zuschuss UL1-TR001866) und dem Shapiro-Silverberg Fund for the Advancement of Translational Research unterstützt. ZW wurde vom Maurice R. and Corinne P. Greenberg Center for the Advancement of Translational Research unterstützt, teilweise durch den Zuschuss UL1 TR001866 des National Center for Advancing Translational Sciences, NIH Clinical and Translational Science Award-Programm. FM wurde vom Bulgari Women & Science Fellowship in der COVID-19-Forschung unterstützt. PDB und MCN sind Forscher des Howard Hughes Medical Institute (HHMI). Dieser Artikel unterliegt der HHMI-Richtlinie zum offenen Zugang zu Veröffentlichungen. HHMI-Laborleiter haben der Öffentlichkeit zuvor eine nicht-exklusive CC BY 4.0-Lizenz und HHMI eine unterlizenzierbare Lizenz für ihre Forschungsartikel gewährt. Gemäß diesen Lizenzen kann das vom Autor akzeptierte Manuskript dieses Artikels sofort nach Veröffentlichung unter einer CC BY 4.0-Lizenz frei verfügbar gemacht werden.

Folgende Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Dennis Schaefer-Babajew, Zijun Wang, Frauke Muecksch, Alice Cho

Labor für Molekulare Immunologie, Rockefeller University, New York, NY, USA

Dennis Schaefer-Babajew, Zijun Wang, Alice Cho, Maximilian Loewe, Melissa Cipolla, Raphael Raspe, Brianna Johnson, Victor Ramos, Martina Turroja, Katrina G. Millard, Juan Dizon, Irina Shimeliovich, Kai-Hui Yao, Thiago Y. Oliveira, Anna Gazumyan, Christian Gaebler, Marina Caskey und Michel C. Nussenzweig

Labor für Retrovirologie, Rockefeller University, New York, NY, USA

Frauke Muecksch, Marie Canis, Justin DaSilva, Fabian Schmidt, Leander Witte, Paul D. Bieniasz & Theodora Hatziioannou

Howard Hughes Medical Institute, New York, NY, USA

Anna Gazumyan, Paul D. Bieniasz und Michel C. Nussenzweig

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DS-B. und MCN konzipierte die Studie. DS-B., ZW, FM, AC, PDB, TH und MCN konzipierten, gestalteten und analysierten Experimente. DS-B., CG und M. Caskey entwarfen klinische Protokolle. DS-B., ZW, FM, AC, ML, M. Cipolla, RR, M. Canis, J. DaSilva., FS, LW und K.-HY führten Experimente durch. BJ und AG produzierten Antikörper. MT, KGM, IS, J. Dizon, CG und M. Caskey rekrutierten Teilnehmer, führten klinische Protokolle durch und verarbeiteten Proben. VR und TYO führten bioinformatische Analysen durch. DS-B. und MCN hat das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Paul D. Bieniasz, Theodora Hatziioannou, Marina Caskey oder Michel C. Nussenzweig.

Die Rockefeller University hat im Zusammenhang mit dieser Arbeit einen vorläufigen Patentantrag eingereicht, in dem MCN als Erfinder aufgeführt ist (US-Patent 63/021.387). Das Patent wurde von der Rockefeller University an Bristol Meyers Squib lizenziert. PDB hat von Pfizer eine Vergütung für Beratungsleistungen im Zusammenhang mit SARS-CoV-2-Impfstoffen erhalten.

Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

af, Monoklonaler Antikörper, der an mutierte Formen von RBD bindet. ac, Diagramme zeigen die konzentrationsabhängige Antikörperbindung an (a) WT-, (b) R436S/E484K- und (c) N440K/E484K-RBDs durch C144, C135 und Klasse 1 (C105), Klasse 2 (C952), Klasse 3 (C881) und Klasse 4 (C149)5,6,8,26. df, Diagramme zeigen die konzentrationsabhängige präpandemische Plasmabindung gesunder Spender an (d) WT-, (e) R436S/E484K- und (e) N440K/E484K-RBDs in Gegenwart (lila) oder Abwesenheit (gepunktete Linien) von 100 mg ml −1 von C135 und C144. Die Zugabe von C144 und C135 zum Plasma erhöht die Bindungsaktivität des Plasmas gegenüber dem WT, nicht jedoch gegenüber den beiden mutierten RBDs. gh, Panels zeigen die Korrelation der Serumspiegel von C135-LS (g) und C144-LS (h) am Tag 84 nach der Verabreichung (ungefähr zum Zeitpunkt der Impfung, wie in Abb. 1b dargestellt) mit dem gesamten Anti-WT-RBD-IgG-Antikörper Titer der mAb-Empfänger (n = 18) nach einer (leere grüne Kreise) und zwei Dosen (durchgezogene grüne Punkte) der mRNA-Impfung. Statistische Signifikanz in g (r = 0,9097 und r = 0,5891 mit p < 0,0001 und p = 0,0101 für vax1 bzw. vax2) und h (r = 0,8772 und r = 0,5483 mit p < 0,0001 und p = 0,0185 für vax1 und vax2, bzw.) wurde mithilfe der zweiseitigen Pearson-Korrelationsstatistik ermittelt. Alle Experimente wurden mindestens doppelt durchgeführt.

a, Diagramme zeigen konzentrationsabhängige Neutralisierungskurven für SARS-CoV-2-Pseudoviren durch monoklonale Antikörper. C144 (rot), C135 (blau) und ihre äquimolare Kombination (lila). b: Präpandemische Plasma-Neutralisierung (Quadrate) von WT- oder R346S/Q493K- oder R346S/N440K/E484K-Pseudoviren in Abwesenheit oder Anwesenheit von 5 (lila gestrichelte Kreise) oder 100 µg ml−1 (lila durchgezogene Kreise) von C135 und C14414 . cd, Wie in (b), jedoch für Rekonvaleszenzplasma mit mittlerer (c, COV157)12 oder starker (d, COV31)12 neutralisierender Aktivität. Die horizontalen Linien in allen Feldern zeigen die halbmaximale Neutralisierung an. e, Plasma-Halbmaximal-Neutralisierungstiter (NT50) gegen HIV-1, pseudotypisiert mit BA.4/5 S38. Jeder Punkt repräsentiert eine Person aus der Kontrollgruppe (n = 31, blau) oder aus der mAb-Empfängergruppe (n = 18, grün). Rote horizontale Balken und rote Zahlen stellen Medianwerte dar. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-Verfahrens bestimmt. Für ad stellen einzelne Symbole den Mittelwert zweier unabhängiger Experimente dar und Fehlerbalken die Standardabweichung. Alle Experimente wurden mindestens doppelt durchgeführt.

a, Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Phänotypisierung. Das Gating erfolgte an einzelnen Lymphozyten, die CD19+ und CD20+ sowie CD3– CD8– CD16– Ova– ohne Aufnahme von Lebend-Tot-Farbstoff (L/D) waren. Antigenspezifische Zellen waren solche mit doppelter Bindung an Wuhan-Hu1 RBD-PE und RBD-AF647. Anti-IgG, -IgM wurden zur Phänotypisierung dualer RBD-markierter B-Zellen verwendet. b,c, Repräsentative Durchflusszytometriediagramme von Wuhan Hu-1 RBD-bindenden Gedächtnis-B-Zellen von mAb-Empfängern nach einer und zwei Impfdosen (b) und Spendern aus der Zeit vor der Pandemie (c), die als Negativkontrollen dienten. Die Zahlen im RBD-Gate geben den Prozentsatz der doppelt markierten RBD-Zellen des Eltern-Gates an (siehe a). Entsprechende Durchflusszytometriediagramme und Gating-Strategien für geimpfte Kontrollen finden sich in11. de, Anzahl der IgG- (d) und IgM-exprimierenden (e) WT-RBD-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen pro 10 Millionen CD20+ B-Zellen. Jeder Punkt stellt eine Person aus der mAb-Empfängergruppe (grün, n = 18) und der Kontrollgruppe (blau, n = 10) dar9,11. Horizontale rote Balken kennzeichnen Medianwerte. fi, Panels zeigen die Korrelation der Serumspiegel von C135-LS (f, g) und C144-LS (h, i) am Tag 84 nach der Verabreichung (ungefähr zum Zeitpunkt der Impfung, wie in Abb. 1b dargestellt) mit dem Prozentsatz der WT RBD-spezifische Gedächtnis-B-Zellen, die nach zwei Impfstoffdosen entweder IgG (f, h) oder IgM (g, i) exprimieren, bestimmt durch Durchflusszytometrie. Grüne Punkte stellen einzelne mAb-Empfänger dar (n = 18). Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der zweiseitigen Mann-Whitney-Methode für d und e bestimmt, und für fi wurde die r-Korrelationsstatistik von Pearson verwendet.

ab, Panels, die die IgG- (a) und IgM-Oberflächenexpression (b) von Anti-RBD-Gedächtniszellen genau wie in Abb. 2b und c zeigen, wobei jedoch die 5 repräsentativen Individuen, deren Zellen anschließend sortiert wurden, gelb hervorgehoben sind. c, Gating-Strategie für die Einzelzellsortierung von RBD-spezifischen Speicher-B-Zellen. Doppelt markierte (RBD-PE+/-AF647+) CD20+ CD3− CD8− CD16− Ova− Zellen wurden sortiert. d: Repräsentative Durchflusszytometriediagramme zeigen RBD-bindende Zellen, die aus den 5 mAb-Empfängern sortiert wurden. e, Kreisdiagramme zeigen die Verteilung von Antikörpersequenzen, die aus Zellen stammen, die von 10 geimpften Kontrollpersonen nach Vax2 isoliert wurden. Das obere Feld zeigt IgM und das untere Feld zeigt IgG-Sequenzen9,11. Die Zahl im inneren Kreis gibt die Anzahl der analysierten Sequenzen für die über dem Kreis angegebene Person an. In Blautönen gefärbte Schnitte weisen auf klonal expandierte Zellen hin (gleiche IGHV- und IGLV-Gene, mit sehr ähnlichen CDR3s). Die Größe des Kuchenstücks ist proportional zur Anzahl der klonal verwandten Sequenzen. Der schwarze Umriss und der %-Wert geben die Häufigkeit klonal erweiterter Sequenzen an, die bei einem Individuum entdeckt wurden. Weiße Kreisflächen geben den Anteil der nur einmal isolierten Sequenzen an. Für C005 wurden zum Untersuchungszeitpunkt keine IgM-Transkripte amplifiziert. fh, Vergleich der Häufigkeitsverteilung der V-Genverwendung für IgH und IgL unter Antikörpern, die aus mRNA-geimpften mAb-Empfängern (diese Studie) und Kontrollen isoliert wurden9,11, nach Vax2 und aus der Datenbank gemeinsamer Klonotypen menschlicher Antikörper von Soto et al .43. Die Grafiken zeigen die relative Häufigkeit menschlicher IGHV- (f), IGKV- (g) und IGLV-(h)-Gene in der menschlichen V-Gendatenbank (in grau, Sequence Read Archive-Zugang SRP010970), Antikörper, die von mAb-Empfängern isoliert (in grün) oder geimpft wurden Bedienelemente (in Blau). Die Farben der Sterne geben den Grad der statistischen Signifikanz für die folgenden Häufigkeitsvergleiche an: Schwarz – geimpfte Kontrollen vs. Datenbank; rot – mAb-Empfänger vs. Datenbank; blau – mAb-Empfänger vs. geimpfte Kontrollen.

ab, Die Felder zeigen die WT-RBD-Bindung und die neutralisierende Aktivität des WT-SARS-CoV-2-S-Pseudotyps einer repräsentativen Reihe monoklonaler Antikörper, die von IgM-exprimierenden RBD-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen stammen und entweder als menschliches IgG1 (IgG, wie in Abb. 3a–) exprimiert werden. c) oder pentameres IgM (IgM5). a, Panel zeigt WT-RBD-EC50s von 15 monoklonalen Antikörpern, die aus geimpften mAb-Empfängern isoliert wurden (siehe auch Ergänzungstabelle 4). Der grau schattierte Bereich zwischen horizontalen gepunkteten Linien zeigt Antikörper mit EC50s >10 µg ml-1 (schlechte Bindung) und nicht bindende Antikörper an, die willkürlich bei 10 bzw. 20 µg ml-1 gruppiert sind. b, Diagramme zeigen IC50s von 2 IgM-abgeleiteten Kontrollantikörpern (die einen breiten Bereich neutralisierender Aktivität abdecken) in Blau und 15 IgM-abgeleiteten monoklonalen Antikörpern von mAb-Empfängern (wie in a) in Grün, ausgedrückt als menschliches IgG1 (IgG) oder Pentamer IgM (IgM5). Für beide Panels (a, b) fassen Ringdiagramme den Anteil der Antikörper in der angegebenen Kategorie unter allen getesteten Personen zusammen (eingekreiste Zahl). Rote horizontale Balken und Zahlen geben Medianwerte an. Für Panel a wurde die statistische Signifikanz mithilfe des zweiseitigen Wilcoxon-Matched-Pairs-Rangtests bestimmt, um Unterschiede zwischen denselben monoklonalen Antikörpern, ausgedrückt als IgG oder pentameres IgM, zu vergleichen, und die Chi-Quadrat-Kontingenzstatistik wurde verwendet, um kategoriale Verteilungen aus Ringdiagrammen zu vergleichen .

ad, BLI-Spuren von Antikörpern, die auf Konkurrenz mit Klassenreferenzantikörpern getestet wurden. Die Spuren zeigen die anfängliche Assoziationskurve (Antigen-Einfangphase des Primärantikörpers) und die anschließende Hinzufügung von Sekundärantikörpern unbekannter Klasse. Dünne durchgezogene schwarze Linien stellen Antikörper dar, die von mAb-Empfängern oder geimpften Kontrollen isoliert wurden. Dicke gestrichelte Linien sind Selbstkonkurrenzspuren von C105 (grün in a), C144 (rot in b), C135 (blau in c) und C2172 (lila in d) für die Klassen 1–4. e, Wärmekarte der relativen Hemmung der sekundären Antikörperbindung an die vorgeformten Fängerantikörper-RBD-Komplexe (grau = keine Bindung, rot = unbeeinträchtigte Bindung, orange = unbestimmt). Das linke Feld zeigt Antikörper von mAb-Empfängern, während das rechte Feld IgM-Antikörper von geimpften Kontrollen zeigt, die in dieser Studie isoliert wurden (beide nach vax2). Einzelheiten zu IgG-Antikörpern, die aus geimpften Kontrollen isoliert wurden, finden Sie in9,11. f, BLI-Spuren, die C2172 als Klasse 4 definieren. C2172 ist der Primär-/Fängerantikörper (in gestricheltem Lila). Die Hinzufügung der bekannten klassendefinierenden Antikörper C105 (in Grün, Klasse 18), C144 (in Rot, Klasse 28), C135 (in Blau, Klasse 38) und C118 (in Orange, Klasse 1/427) etablieren C2172 als echter Antikörper der Klasse 4.

a: Gating-Strategie für die durchflusszytometrische Phänotypisierung von Keimzentrums-B-Zellen, die aus den drainierenden (poplitealen) Lymphknoten von WT C57BL/6-Mäusen isoliert wurden, die 11 Tage zuvor mit rekombinantem SARS-Cov-2 RBD immunisiert wurden (wie in Abb. 4a dargestellt). Das Gating erfolgte an einzelnen Lymphozyten, die B220+ und CD4− CD8a− NK1.1− F4/80− (abstammungsnegativ) waren, ohne Aufnahme von Lebend-Tot-Farbstoff (L/D). Bei den B-Zellen des Keimzentrums handelte es sich um solche, die CD38− GL7+ CD95 (Fas)+ waren. Antigenspezifische Zellen waren solche mit doppelter Bindung an Wuhan-Hu1 RBD-PE und RBD-AF647. b, Repräsentative Durchflusszytometriediagramme von Wuhan Hu-1 RBD-bindenden Keimzentrums-B-Zellen von Mäusen, die entweder die Kombination von C135 und C144 (Anti-RBD-mAb-Gruppe) oder die irrelevanten Anti-HIV-Kontrollantikörper 3BNC117 und 10– erhalten hatten. 1074 (Anti-HIV-mAb-Kontrollen) einen Tag vor der Immunisierung, wobei der Prozentsatz der Bindungszellen innerhalb des jeweiligen Gates angegeben ist. cd, Panels zeigen die Gesamtzahl der CD38− GL7+ CD95 (Fas)+ Keimzentrums-B-Zellen (c) und RBD-bindenden Keimzentrums-B-Zellen (d), isoliert aus vorbehandeltem Anti-RBD-mAb (n = 6, grün) und Kontrollmäuse (n = 6, blau), wobei jeder Punkt einer einzelnen Maus entspricht. e, Somatische Hypermutationsniveaus (SHM) von aus Keimzentrums-B-Zellen stammenden monoklonalen Antikörpern, dargestellt als kombinierte Nukleotidsubstitutionen der variablen Region der schweren und leichten Kette plus eins (IGVH+IGVL+1), wobei jeder Punkt eine Sequenz aus Anti-Antikörpern darstellt. Mit RBD-mAb vorbehandelte Mäuse (grün) oder Kontrollen (blau). Ringdiagramme unter jeder Spalte zeigen den Anteil der Sequenzen ohne (IGVH+IGVL+1 = 1) vs. mit keinem (IGVH+IGVL+1 > 1) SHM unter allen analysierten Sequenzen (eingekreiste Zahl) für die jeweilige Gruppe. f, Prozentsatz der Sequenzen, die zu Klonen gehören, definiert als 2 oder mehr Sequenzen mit denselben IGHV- und IGLV-Genen und mit sehr ähnlichen CDR3s, unter allen vom jeweiligen Tier erhaltenen Sequenzen (wie in Abb. 4d). Jeder Punkt stellt eine einzelne Maus aus der Anti-RBD-mAb- (n = 6, grün) oder Kontrollgruppe (n = 6, blau) dar. g, Affinitätskonstanten (Kd) von aus Keimzentrums-B-Zellen stammenden Fabs für WT SARS-CoV-2 RBD, ermittelt aus der monovalenten Wechselwirkung von Fabs mit RBD-Monomeren durch BLI (siehe auch Abb. 4f – i, Ergänzungstabelle 6). und Methoden). Jeder Punkt stellt einen einzelnen Fab aus der Anti-RBD-mAb- (n = 8, grün) oder Kontrollgruppe (n = 22, blau) dar. Rote horizontale Balken (cg) und Zahlen (e, g) geben Median- (c, d, f, g) und Mittelwerte (e) an. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung des zweiseitigen Mann-Whitney-Tests für cg d bestimmt, und der zweiseitige exakte Fisher-Test wurde verwendet, um den relativen Beitrag mutierter und nicht mutierter Sequenzen in e zu testen.

Beschreibungen für die Ergänzungstabellen 1–6.

Kohortenmerkmale.

Individuelle Teilnehmermerkmale.

Sequenzen menschlicher Anti-SARS-CoV-2-RBD-Antikörper.

Sequenzen, RBD-ELISA-Bindung, Neutralisierung, Affinität und Epitope geklonter rekombinanter menschlicher Anti-SARS-CoV-2-RBD-Antikörper.

Sequenzen von B-Zell-Antikörpern gegen das Keimzentrum der Maus.

Sequenzen und Bindungsaffinitäten geklonter rekombinanter monoklonaler Maus-Keimzentrum-Fab-Fragmente.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schaefer-Babajew, D., Wang, Z., Mücksch, F. et al. Antikörper-Feedback reguliert das Immungedächtnis nach der SARS-CoV-2-mRNA-Impfung. Natur 613, 735–742 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05609-w

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Eingegangen: 04. Juni 2022

Angenommen: 30. November 2022

Veröffentlicht: 06. Dezember 2022

Ausgabedatum: 26. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05609-w

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